Effetti del modafinil sul comportamento e sui parametri di danno ossidativo nel cervello dei ratti Wistar
Abstract
Sono stati valutati gli effetti del modafinil (MD) sul comportamento e sul danno ossidativo a proteine e lipidi nel cervello dei ratti. Ai ratti Wistar è stata data una singola somministrazione tramite gavage di acqua o MD (75, 150 o 300 mg/kg). I parametri comportamentali sono stati valutati in un apparato di campo aperto 1, 2 e 3 ore dopo la somministrazione del farmaco. Le sostanze reattive dell’acido tiobarbiturico (TBARS) e la formazione di carbonile proteico sono state misurate nel cervello. MD ha aumentato l’attività locomotoria alla dose più alta 1 e 3 ore dopo la somministrazione. La somministrazione di MD alla dose di 300 mg/kg ha aumentato le visite al centro di campo aperto 1 h dopo la somministrazione; tuttavia, 3 h dopo la somministrazione, tutte le dosi somministrate di MD hanno aumentato le visite al centro di campo aperto. Il MD 300 mg/kg ha aumentato i danni lipidici nell’amigdala, nell’ippocampo e nello striato. Inoltre, MD ha aumentato il danno proteico nella corteccia prefrontale, nell’amigdala e nell’ippocampo; tuttavia, questo effetto varia a seconda della dose somministrata. Al contrario, la somministrazione di MD 75 e 300 mg/kg ha diminuito il danno proteico nello striato. Questo studio ha dimostrato che la somministrazione di MD induce cambiamenti comportamentali, che dipendeva dalla dose utilizzata. Inoltre, gli effetti di MD sui parametri di danno ossidativo sembrava essere in regione del cervello specifico e dosi.
1. Introduzione
Modafinil (MD) è un farmaco psicoattivo non anfetaminergico frequentemente prescritto per il trattamento del sonno, come la narcolessia, la sindrome di apnea ostruttiva del sonno e il disturbo del sonno da lavoro a turni. Inoltre, è ben descritto in letteratura che MD migliora la funzione in una serie di domini cognitivi così come la memoria di lavoro e la memoria episodica. Questi effetti di MD sulla memoria sono stati descritti anche in pazienti psichiatrici, suggerendo che questo farmaco è un eccellente agente candidato per il trattamento della disfunzione cognitiva nei disturbi psichiatrici. Inoltre, la ricerca clinica ha dimostrato che MD migliora i sintomi in pazienti con depressione maggiore, disturbo bipolare, schizofrenia e disturbo da deficit di attenzione/iperattività (ADHD).
Il meccanismo d’azione di MD è poco conosciuto; tuttavia, è noto che questo farmaco ha un effetto importante sulle catecolamine, serotonina, glutammato, acido gamma aminobutirrico, orexina e sistemi di istamina nel cervello. Inoltre, gli studi dimostrano che il MD inibisce il trasportatore di dopamina, aumentando la neurotrasmissione dopaminergica nei circuiti di vigilanza. Psicostimolanti come l’anfetamina, che agiscono anche su vari sistemi di neurotrasmettitori, hanno dimostrato di avere un effetto pronunciato sul comportamento, compresa la generazione di paura, ansia e iperattività. Tuttavia, il MD è meno legato a effetti collaterali come iperattività, ansia, nervosismo o effetti di rimbalzo rispetto agli stimolanti tradizionali.
Diversi studi hanno suggerito che la somministrazione di psicostimolanti può portare allo stress ossidativo nel cervello dei ratti. Il cervello è particolarmente vulnerabile alla produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) perché metabolizza il 20% dell’ossigeno totale del corpo e ha una quantità limitata di capacità antiossidante. La somministrazione cronica di psicostimolanti come il metilfenidato, la m-anfetamina e la d-anfetamina nei ratti ha indotto un aumento della produzione di superossido, danni ossidativi a proteine, lipidi e DNA e cambiamenti negli enzimi antiossidanti e nei complessi della catena respiratoria mitocondriale.
Pertanto, lo scopo del presente studio era valutare l’effetto del MD sul comportamento e sui parametri di stress ossidativo nell’ippocampo, nella corteccia prefrontale, nell’amigdala e nello striato dei ratti.
2. Metodi sperimentali
2.1. Animali
I soggetti erano ratti Wistar maschi adulti (peso 250-350 g) ottenuti dalla nostra colonia di allevamento. Gli animali sono stati alloggiati in cinque in una gabbia con cibo e acqua disponibili ad libitum e sono stati mantenuti in un ciclo luce/buio di 12 ore (luci accese alle 7:00 del mattino) a una temperatura di °C. Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite in conformità con l’approvazione del comitato etico locale per l’uso degli animali presso l’Universidade do Extremo Sul Catarinense. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti alla stessa ora durante il giorno per evitare variazioni circadiane.
2.2. Farmaci e procedure farmacologiche
Il MD (Libbs Farmacêutica Ltda) è stato sospeso nel veicolo-veicolo: 1% di metilcellulosa in acqua. Le soluzioni sono state preparate immediatamente prima dell’uso e sono state protette dalla luce durante la sessione sperimentale. La soluzione sospesa era sotto agitazione durante tutto il periodo di iniezione. Il gruppo di controllo ha ricevuto il veicolo.
2.3. Disegno sperimentale
Il numero totale di ratti usati in questo esperimento era 40 (animali per gruppo). Gli animali hanno ricevuto una singola dose di MD (75, 100, o 300 mg/kg di peso corporeo) in un volume di 1 mL/kg, somministrato tramite gavage. Il gruppo di controllo ha ricevuto il veicolo in un volume di 1 mL/kg. L’attività locomotoria è stata misurata 1, 2 e 3 ore dopo l’iniezione, e i ratti sono stati uccisi per decapitazione subito dopo il compito in campo aperto.
2.4. Attività locomotoria
L’attività locomotoria è stata valutata utilizzando il compito in campo aperto come precedentemente descritto. Questo compito è stato eseguito in un campo aperto 40 × 60 cm circondato da pareti alte 50 cm, fatte di compensato marrone, con il pavimento diviso in 9 quadrati uguali da linee nere. Gli animali sono stati posti delicatamente sul rettangolo posteriore sinistro e lasciati liberi di esplorare l’arena per 5 minuti. Nel test in campo aperto, sono stati valutati i seguenti parametri comportamentali.
Attraversamenti (attività locomotoria/attività orizzontale): è stato contato il numero totale di quadrati attraversati dai ratti in tutto il periodo del test.
Indietro (attività esplorativa/attività verticale): è stato contato il totale della postura eretta dei ratti in tutto il periodo del test.
Visite al centro del campo aperto: è stato contato il numero totale di visite al centro del campo aperto. Un quadrato centrale di cm è stato definito come l’area “centrale” del campo.
2.5. Misura dei marcatori di danno ossidativo
I ratti sono stati trattati con MD o acqua come descritto sopra e sono stati uccisi per decapitazione 3 ore dopo l’ultima iniezione e il loro cervello è stato rimosso e sezionato per la valutazione dei livelli di danno ossidativo nella corteccia prefrontale, amigdala, ippocampo e striato. TBARS e formazioni di carbonile proteico sono stati misurati come precedentemente descritto.
2.6. La formazione di TBARS durante una reazione di riscaldamento acido è stata misurata come un indice della produzione di ROS, che è ampiamente adottato come metodo sensibile per la misurazione della perossidazione lipidica, come precedentemente descritto. In breve, i campioni sono stati mescolati con 1 mL di acido tricloroacetico 10% (TCA) e 1 mL di acido tiobarbiturico 0,67% (TBA) e poi riscaldati in un bagno di acqua bollente per 15 minuti. I TBARS sono stati determinati dall’assorbanza a 535 nm. I risultati sono espressi come MDA (malondialdeide) equivalenti (nmol/mg di proteine).
2.7. Il danno ossidativo alle proteine è stato valutato mediante la determinazione dei gruppi carbonilici basati sulla reazione con la dinitrofenilidrazina (DNPH) come precedentemente descritto. In breve, le proteine sono state precipitate con l’aggiunta del 20% di acido tricloroacetico e ridisciogliute in DNPH e l’assorbanza letta a 370 nm.
2.8. Analisi statistica
2.8. Analisi statistica
Tutte le analisi sono state effettuate con il pacchetto statistico per le scienze sociali versione 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Tutti i dati sono presentati come media ± SEM. Le differenze tra i gruppi nell’analisi comportamentale sono state verificate utilizzando misure ripetute analisi della varianza per accedere alla curva di risposta tempo, seguita da test post hoc di Tukey. Per verificare le differenze tra i gruppi in analisi biochimica, abbiamo usato ANOVA, seguita da test post hoc di Tukey. In tutti gli esperimenti, i valori < 0,05 sono stati considerati per indicare la significatività statistica.
3. Risultati
3.1. Analisi del comportamento
Per l’analisi della locomozione (attraversamenti) (Figura 1(a)), l’analisi delle misure ripetute della varianza ha rivelato differenze significative per la somministrazione di MD (F(3.35) = 7.91, ) e per le ripetizioni comportamentali (F(2.7) = 54.82, ). Ulteriori analisi con il test post hoc di Tukey hanno mostrato che il MD a 300 mg/kg ha aumentato la locomozione spontanea dei ratti rispetto al gruppo di controllo 1 h dopo la somministrazione. Inoltre, il gruppo di controllo, MD a 75 mg / kg, e MD a 150 mg / kg visualizzato ridotto numero di attraversamenti quando riesposto 3 h più tardi per il campo aperto, indicando così assuefazione all’ambiente. Tuttavia, MD a 300 mg / kg ratti trattati visualizzato un numero ridotto di attraversamenti quando riesposti 2 e 3 h ultimo al campo aperto. Questa differenza può essere spiegata dalla iperattività motoria indotta 1 h dopo la somministrazione di MD alla dose di 300 mg/kg.
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Per l’analisi di esplorazione (rearings) (Figura 1 (b)), l’analisi delle misure ripetute della varianza ha rivelato differenze significative per le ripetizioni comportamentali (F(2.7) = 32.7, ). Ulteriori analisi con test post hoc di Tukey ha mostrato che il gruppo di controllo, MD a 75 mg / kg, e MD a 150 mg / kg visualizzati ridotto numero di allevamenti quando riesposto 3 h ultimo al campo aperto. MD a 300 mg / kg diminuito il numero di allevamenti quando riesposti 2 e 3 h ultimo al campo aperto.
Per l’analisi delle visite al centro di campo aperto (Figura 1 (c)), l’analisi delle misure ripetute della varianza ha rivelato differenze significative per la somministrazione MD (F (3.34) = 15.70, ). Ulteriori analisi con il test post hoc di Tukey hanno dimostrato che il MD a 300 mg/kg ha aumentato le visite al centro del campo aperto rispetto al controllo 1 h dopo la somministrazione. Inoltre, MD a tutte le dosi somministrate aumentato visite al centro del campo aperto 3 h dopo la somministrazione.
3.2. Analisi biochimica
Come mostrato nella Figura 2 (a), i livelli di TBARS sono stati significativamente aumentati nell’amigdala (F (3) = 4.18, ), ippocampo (F (3) = 44.9, ), e striato (F (3) = 7.07, ) di ratti trattati con MD a 300 mg / kg rispetto al gruppo di controllo.
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4. Discussione
Nel presente studio, abbiamo osservato che una singola iniezione di MD in una dose elevata (300 mg/kg) induce iperlocomozione nei ratti, che non rimane 2 e 3 ore dopo la somministrazione. Secondo i nostri risultati, MD significativamente aumentato l’attività locomotoria e aumentato i livelli di dopamina extracellulare striatale nelle scimmie rhesus. Young e colleghi hanno dimostrato che il MD ha aumentato l’attività, l’impennata e la scorrevolezza dei percorsi locomotori nei topi C57BL/6J e 129/SJ. Queste alterazioni indotte dal comportamento MD erano legate all’aumento della dopamina sinaptica e alle azioni secondarie mediate dai recettori della dopamina drd1 e drd4. A differenza dello studio di cui sopra, anche se c’è una tendenza, non si osserva un aumento significativo del comportamento esplorativo dopo la somministrazione di MD. Questa discrepanza può essere spiegata dalle differenze nella metodologia, specie e tempo di trattamento.
Qui, abbiamo osservato che il gruppo di controllo e MD a basse dosi (75 e 150 mg / kg) ha ridotto il numero di attraversamenti e rearings quando riesposto 3 ore dopo al campo aperto, indicando assuefazione all’ambiente. Il MD a dosi elevate (300 mg/kg) ha ridotto il numero di attraversamenti e di attacchi posteriori quando è stato riesposto 2 e 3 ore dopo al campo aperto. Questa discrepanza può essere spiegata dal fatto che 1 h dopo la somministrazione di MD (300 mg/kg) ha aumentato significativamente il numero di attraversamenti e una tendenza ad aumentare il numero di allevamenti. Si ritiene che l’assuefazione a un nuovo ambiente sia una delle forme più elementari di apprendimento non associativo. L’esposizione ripetuta allo stesso ambiente induce una riduzione del comportamento esplorativo, che può essere preso come un indice di assuefazione.
Un risultato interessante dello studio attuale è stato che MD modulato comportamento legato all’ansia. Nel test in campo aperto, i ratti trattati con MD erano meno ansiosi e anche tendevano ad esplorare la zona centrale aversiva più dei controlli. MD a 300 mg / kg aumentato il numero di visite al centro del campo aperto 1 h dopo la somministrazione. Inoltre, MD a tutte le dosi somministrate aumentato visite al centro del campo aperto 3 h dopo la somministrazione. In letteratura, gli studi sono controversi circa l’effetto del MD sull’ansia. Studi preclinici hanno mostrato o nessun effetto del modafinil sull’ansia o un effetto ansiolitico. Allo stesso modo, MD negli studi clinici mostra un effetto ansiolitico o nessun effetto sull’ansia, mentre altri dimostrano un effetto ansiogeno. Questa differenza tra gli studi può essere spiegata dalla variazione nelle dosi utilizzate (100 mg, 200 mg o 400 mg) e nel programma di dosaggio (una sola volta contro il dosaggio cronico per una settimana o più). Gli effetti simil-ansiolitici del MD possono essere spiegati dai suoi effetti sull’amigdala, che è una regione del cervello implicata nell’ansia, agli stimoli minacciosi. Uno studio precedente ha mostrato che il MD diminuisce la reattività dell’amigdala agli stimoli di paura. È noto che l’amigdala è ricca di proiezioni catecolaminergiche e serotoninergiche, e quindi probabilmente il MD riduce la reattività dell’amigdala attraverso cambiamenti nella segnalazione intra-amigdala derivanti da alterazioni nei sistemi di noradrenalina, dopamina, serotonina, o GABA o da una combinazione di questi effetti.
Oltre a indurre cambiamenti comportamentali, è ben descritto in letteratura che gli psicostimolanti causano danni ossidativi sia in modelli animali che nell’uomo. I nostri risultati mostrano che il MD aumenta il danno ossidativo ai lipidi e alle proteine nel cervello dei ratti. I livelli di TBARS sono stati aumentati nell’amigdala, nell’ippocampo e nello striato dei ratti trattati con MD a dosi elevate (300 mg/kg). Inoltre, abbiamo osservato un aumento della generazione di carbonile dopo la somministrazione di MD nella corteccia prefrontale alla dose di 300 mg/kg e nell’amigdala e nell’ippocampo a 75 mg/kg. Gli studi dimostrano che il MD inibisce il trasportatore della dopamina, aumentando la neurotrasmissione dopaminergica. L’aumento della concentrazione di dopamina extracellulare indotta dal MD può indurre la sovrapproduzione del metabolita tossico dell’ossidazione della dopamina, portando a danni ossidativi alle proteine e ai lipidi nel cervello dei ratti. In letteratura, non ci sono studi che valutano le lesioni cerebrali dopo la somministrazione di MD; tuttavia, questi studi sono molto importanti dato che l’accessibilità di MD, come il farmaco che aumenta l’allerta, la memoria e l’antifatica, per le persone sane è in aumento.
Conversamente, il trattamento con MD (75 e 300 mg/kg) ha ridotto la generazione di carbonile nello striato rispetto al gruppo di controllo. Alcuni studi hanno dimostrato il potenziale neuroprotettivo striatale di MD. Studi precedenti mostrano un miglioramento della sopravvivenza dei neuroni dopaminergici intossicati da 1-metil-1,2,3,6-tetraidropiridina nello striato dopo il trattamento con MD, in un modello animale di malattia di Parkinson. Raineri e colleghi hanno dimostrato che la somministrazione di MD ha attenuato la neurotossicità indotta dalla metanfetamina nello striato dei topi, suggerendo un possibile ruolo protettivo di MD in questa regione del cervello. MD ha dimostrato di migliorare l’apprendimento nei pazienti dipendenti da metanfetamina. I risultati qui presentati suggeriscono che la somministrazione di MD potrebbe mostrare proprietà antiossidanti nello striato; tuttavia, l’effetto protettivo di MD sullo striato è ancora sconosciuto. Striato integra input glutamatergici dalla corteccia e talamo con afferenze dopaminergiche dal mesencefalo. La segnalazione della dopamina gioca un ruolo preminente nell’apprendimento striatale dipendente e nella plasticità sinaptica dei neuroni di proiezione medium spiny. Rossato e colleghi hanno dimostrato che l’infusione dell’agonista del recettore D1 ha aumentato i livelli di fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF) e di conseguenza la plasticità sinaptica. Così, MD può essere promuovere la plasticità sinaptica attivando il sistema dopaminergico e di conseguenza proteggere lo striato contro il danno ossidativo.
In conclusione, siamo in grado di dimostrare che (1) MD induce iperattività ad alta dose (300 mg / kg) 1 h dopo la somministrazione, che non rimane 2 e 3 ore dopo la somministrazione. (2) MD ha mostrato effetti ansiolitici nei ratti, aumentando il numero di visite al centro del campo aperto. (3) MD ha indotto danni ossidativi ai lipidi e alle proteine nel cervello di ratto; tuttavia, il danno ossidativo dipende dalla regione del cervello analizzata e dalla dose di MD somministrata. (4) Infine, MD potrebbe proteggere lo striato dai danni ossidativi alle proteine. Bisogna prestare attenzione quando si interpretano i risultati. In primo luogo, le difese antiossidanti non sono stati misurati; come questo è il primo studio per esaminare l’impatto di MD sullo stress ossidativo, riconosciamo che avrebbe potuto aiutare nell’interpretazione dei risultati. Tuttavia, in secondo luogo, MD è stato somministrato a ratti sani; gli effetti di MD sul danno ossidativo in modelli animali di malattia mentale può mostrare risultati diversi.
Conflitto di interessi
Gli autori dichiarano che non vi è alcun conflitto di interessi per quanto riguarda la pubblicazione di questo articolo.
Riconoscimenti
Il Laboratorio di Neuroscienze (Brasile) è uno dei centri dell’Istituto Nazionale di Medicina Traslazionale (INCT-TM) e uno dei membri del Centro di Eccellenza in Neuroscienze Applicate di Santa Catarina (NENASC). Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni del CNPq, FAPESC, Instituto Cérebro e Mente, e UNESC. João Quevedo è ricercatore del CNPq e Roger B. Varela, Wilson R. Resende, e Amanda V. Steckert sono titolari di una borsa di studio CAPES; Samira S. Valvassori è titolare di una borsa di studio del CNPq.