Reagenti per la coltura cellulare

Uno stock di glicerolo di Akt1 ORF umano è stato ottenuto come vettore pENTR221 da GE Dharmacon (Akt1 ORF umano clone ID 100067600). Il vettore di destinazione modificato (pcDNA/FRT/TO), contenente SH Tag, è stato un generoso dono del Dr. Matthias Gstaiger (Institute of Molecular Systems Biology, ETH Zurich, Zurigo, Svizzera). Flp-In TREx cellule HEK293 (#R780-07), LR Clonase II mix enzimatico (#11791-100), vettore pOG44 (#V6005-20), Zeocin (#46-0509), Blasticidin S (#R210-01), Hygromycin B (#10687-010), Tet (#550205) e Dynabeads Protein A (#100.02D) sono stati ottenuti da Invitrogen. Xtremegene 9 (#06365787001) è stato acquistato da Roche. DMEM (#12430-054) e RPMI 1640 (#22400-089) sono stati ottenuti da GIBCO. La tripsina (#CC5027.010L) è stata acquistata da Genetics. FBS normale (#SH30070.03) così come Tet FBS schermato (#SH30070.03T) sono stati acquistati da Hyclone. Aphidicolin (#A0781-10MG), Nocodazole (#M1404-10MG), ioduro di propidio (#P4170-250 mg) e Lys C proteasi (#P3428) sono stati ottenuti da Sigma. Le etichette SILAC sono state procurate da Cambridge Isotope Laboratories, Inc. Il cocktail di inibitori di proteasi (100X) (#78429) e le perle di agarosio Pierce anti-HA (#26182) sono stati ottenuti da Thermo Scientific. Le perle MagStrep ‘Tipo 2HC’ (#2-1612-002) sono state ottenute da IBA BioTagnology. Bioconcept Labs Pvt Ltd, Gurgaon, India ha sintetizzato il peptide HA. La membrana di nitrocellulosa (#RPN303E) è stata acquistata da GE Healthcare. La tripsina proteasi (#4370282) è stata procurata da AB Sciex. La gamma completa di marcatori di peso molecolare delle proteine dell’arcobaleno (#RPN800E) è stata acquistata da Amersham. I siRNA, il reagente di trasfezione Dharmafect (#T-2001-03), l’acqua senza RNasi (#B-003000-WB-100), il tampone 5X siRNA (#B-002000-UB-100) sono stati ottenuti dalla Dharmacon. La RNasi A (#19101) era della Qiagen.

Anticorpi per Western Blot

Gli anticorpi usati nel presente studio erano: anti-HA (#SC-7392; monoclonale di topo, diluizione 1:3000); anti-AKT1 (#SC-5298; monoclonale di topo, diluizione 1:1000) e anti-GAPDH (#SC-25778; coniglio policlonale, diluizione 1:1000) di Santa Cruz; anti-CDC2 (#77055; coniglio policlonale, diluizione 1:1000); anti-CCNB1 (#4138; coniglio policlonale, diluizione 1:1000) da Cell Signalling Technology; anti-BUB3 (#ab133699; coniglio monoclonale, diluizione 1:10000); anti-API5 (#ab56392; mouse monoclonale, diluizione 1:1000) e anti-SH3PX1 (#EPR14399; coniglio monoclonale, diluizione 1:2000) da Abcam; gli anticorpi secondari sono stati procurati da Licor Biosciences-Odyssey goat anti-mouse (#926-32210, diluizione 1:15000) e Odyssey goat anti-rabbit (#926-32211, diluizione 1:15000).

Generazione di una linea cellulare stabile

In questo studio, il vettore di ingresso Akt1 compatibile con il gateway (pENTR221) è stato utilizzato per generare un costrutto di espressione mediante reazione di ricombinazione LR in presenza di un vettore di destinazione adatto (pcDNA/FRT/TO). Il vettore di destinazione è stato modificato per includere un tag Strep-HA (SH) contenente un peptide legato alla streptavidina (Strep) e un tag epitopo emagglutinina (HA). Questo tag SH è stato infine utilizzato per estrarre selettivamente Akt1 e i suoi partner di interazione da lisati cellulari complessi. Per generare una linea cellulare di espressione Akt1 inducibile, il costrutto di espressione è stato co-trasfettato con pOG44 ricombinasi in cellule HEK293 Flp-In TREx, che esprimono stabilmente il repressore Tet. La trasfezione è stata facilitata dal reagente di trasfezione Xtremegene 9. Le cellule che esprimono il costrutto Akt1 sono state selezionate per un periodo di 15-20 giorni in hygromycin-B (75 µg/ml) contenente terreno RPMI, integrato con 10% di FBS schermato da Tet. Queste cellule selezionate sono state successivamente raggruppate per espandersi per gli esperimenti di pulldown.

La concentrazione di Tet necessaria per l’espressione ottimale di Akt1 è stata determinata inducendo l’espressione di Akt1 in un intervallo di concentrazioni di Tet (da 0,1 µg/ml a 5 µg/ml) e i livelli di espressione proteica di Akt1 sono stati monitorati in presenza e assenza di Tet utilizzando l’anticorpo anti-Akt1 e anti-HA. Tet è stato integrato ai mezzi di coltura ogni 24 ore per sostenere l’espressione stabile di Akt.

PDT Esperimento

PDT per le cellule HEK293 è stato monitorato in cellule normali rispetto a quelle Akt1-overexpressing per una durata di 72 ore dopo la somministrazione iniziale di Tet. Per ogni punto di osservazione, una serie parallela di 104 cellule HEK293 normali e Akt1-riespresse sono state seminate in triplicato, in una piastra a 96 pozzetti in 100 µl di media DMEM contenente 10% di siero. Il Tet è stato aggiunto ai mezzi di coltura 24 ore dopo la semina e dopo un altro intervallo di incubazione di 24 ore, le cellule sono state raccolte come tempo 0. In seguito, un set di cellule, in coltura parallela, è stato raccolto ogni 24 ore fino a 72 ore. La PDT è stata determinata contando le cellule ad ogni punto di tempo con il metodo di colorazione blu trypan.

L’etichettatura SILAC per differenziare l’interactome di Akt1 specifico per la fase del ciclo cellulare

Le cellule HEK293 sovraesposte a Akt1 sono state espanse e coltivate in mezzi SILAC contenenti isotopi “leggeri” (K0R0), “medi” (K6R6) o “pesanti” (K8R10) di lisina (K) e arginina (R) per almeno 5 raddoppiamenti cellulari per permettere la completa incorporazione delle etichette. Al 70% di confluenza, Tet (1 µg/ml) è stato aggiunto ai media per indurre l’espressione di Akt1. Le cellule etichettate K0R0 sono state arrestate in fase G0 mediante inedia del siero durante la notte, che è un metodo ampiamente utilizzato per arrestare le cellule in fase G042. Per fare questo, i normali mezzi di coltura completi sono stati sostituiti con RPMI privato di siero e le cellule sono state mantenute in coltura per 16-18 ore a 37 °C in atmosfera al 5% di CO2. Le cellule etichettate K8R10 sono state arrestate in fase G1/S coltivando le cellule per una notte in presenza di 5 µg/ml di afidicolina, un inibitore reversibile della replicazione nucleare del DNA eucariotico43. Allo stesso modo, per l’arresto in fase G2, 400ng/ml di nocodazolo sono stati aggiunti ai mezzi di coltura delle cellule etichettate K6R6 e l’incubazione è stata continuata per 16-18 ore prima della pellettizzazione delle cellule. Il nocodazolo interferisce con la polimerizzazione dei microtubuli arrestando così le cellule in fase G2/M44. Le cellule arrestate sono state tripsinizzate e contate separatamente con il metodo di colorazione blu trypan. Le cellule arrestate in diverse fasi del ciclo cellulare sono state poi pellettate mediante centrifugazione a 1500 rpm per 10 minuti. Più pellet di cellule sono stati fatti per ogni fase del ciclo cellulare e conservati a -80 °C, fino all’utilizzo.

SH-tagged Affinity Purification

Lo stesso numero di cellule Akt1-overexpressing arrestate nelle fasi G0, G1/S e G2 sono state mescolate in rapporto 1:1:1 e lisate su ghiaccio per 1 ora in tampone IP (150 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl pH7.5; 1% NP-40; 1X cocktail inibitore della proteasi e 1 mM PMSF). Il lisato cellulare è stato ripulito dai detriti dopo la separazione centrifuga a 10.000 rpm per 15 minuti a 4 °C. Akt1 complessi proteici sono stati selettivamente purificati in gruppi paralleli mirando Strep e HA tag contemporaneamente, come indicato nei manuali dei rispettivi kit. Brevemente, strep-tagged Akt1 proteina complessi sono stati mescolati con 100 µl streptactin perline magnetiche e mantenuto per 1 ora di incubazione su un agitatore rotante a 4 ° C. Tutti gli interagenti non specifici sono stati lavati via durante cinque fasi di lavaggio consecutive con cinque volumi di tampone di lavaggio streptactin. La proteina Akt1 e i suoi interagenti sono stati infine eluiti in due fasi di eluizione con 125 µl di tampone di eluizione strep per eluizione (invitrogen). Per la purificazione dei complessi proteici Akt1 legati a HA, i lisati cellulari puliti sono stati incubati con 50 µl di perline di agarosio HA prelavate per 2 ore a 4 °C su un agitatore rotante. Dopo 3 lavaggi rapidi, con dieci volumi di tampone TBS-T, i complessi proteici Akt1 sono stati eluiti tre volte con 50 µl di peptide HA (250 µg/ml). I passaggi di purificazione di cui sopra sono stati eseguiti per tre repliche biologiche per purificare la proteina Akt1 e i suoi partner di interazione e gli eluati Strep e HA per ogni replica sono stati messi in comune, liofilizzati e salvati a -80 ° C fino a ulteriore elaborazione.

Digestione delle proteine e preparazione del campione per LC-MS/MS

Tutti e tre i replicati biologici sono stati trattati per la digestione delle proteine separatamente. Al campione liofilizzato sono stati aggiunti 40 µl di bicarbonato di ammonio 100 mM, agitati bene, seguiti dall’aggiunta di 2 µl di tampone denaturante (AB Sciex). I campioni sono stati ridotti con 4 µl di reagente riducente (AB Sciex) per 1 ora a 60 °C. Sono stati aggiunti 2 µl di reagente bloccante della cisteina per 10 minuti a temperatura ambiente per bloccare i residui di cisteina ridotti. La digestione delle proteine è stata avviata aggiungendo 5 µl di 0,1 µg/µl di endo-proteinasi Lys C. I campioni sono stati tenuti in incubazione per 4 ore in un bagno d’acqua a 37 °C. Dopo una breve rotazione, 1 µl di tripsina (1 µg/µl) è stato aggiunto ai campioni e ha continuato l’incubazione per altre 12-16 ore a 37 °C. La digestione delle proteine è stata terminata aggiungendo una goccia di acido formico (FA).

I campioni acidificati sono stati liofilizzati e sottoposti a purificazione del peptide utilizzando colonne monospin C-18. Prima dell’uso, le colonne C-18 sono state condizionate con metanolo e acqua e ulteriormente equilibrate con 3% ACN in 0,1% FA. I campioni liofilizzati sono stati sciolti in 3% ACN in 0,1% FA e caricati su colonne C-18 e lasciati legare per 10 minuti. I campioni sono stati passati due volte attraverso le colonne per garantire un legame completo. Dopo 10 lavaggi rigorosi con 3% ACN in 0,1% FA, i peptidi digeriti sono stati eluiti prima in 40% ACN seguita da due eluizioni in 60% ACN. Infine, i tre eluiti sono stati messi in comune e liofilizzati, per ogni replica.

I peptidi eluiti sono stati ridissolti in 500 µl di formiato di ammonio 5 mM (pH 2,5) in 30% ACN e delicatamente vortexati. La cartuccia a scambio cationico è stata fissata e condizionata prima di caricare il campione. Dopo il caricamento del campione, la cartuccia è stata lavata tre volte con formiato di ammonio 5 mM (1 ml). I peptidi sono stati rieluiti due volte con 400 µl di formiato di ammonio 500 mM (pH 2,5) in 30% ACN per eluizione e gli eluati sono stati raggruppati per ogni replica del campione e liofilizzati.

Progetto sperimentale di spettrometria di massa e razionale statistico

AnalisiLC-MS/MS

Tutti i campioni sono stati analizzati mediante cromatografia liquida nano-flow su un sistema nanoflex (Eksigent Technologies, AB Sciex) accoppiato a uno spettrometro di massa triplo TOF 5600 (AB Sciex; Concord, Canada). Ogni replica biologica è stata iniettata due volte come repliche tecniche. Il sistema è stato utilizzato utilizzando un gradiente di fase binaria, con solvente A (2% ACN in 0,1% FA) e solvente B (98% ACN in 0,1% FA). Per una riproducibilità ottimale dell’erogazione del campione, il campionatore automatico è stato azionato in modalità di iniezione completa, riempiendo eccessivamente il loop da 1 µl con 3 µl di campione. Per le misurazioni di ogni iniezione di campione, i peptidi sono stati intrappolati su una trappola cHiPLC, 3 µm, Chrom XP C18CL, 120 Å, 0,5 mm × 200 µm (Eksigent) e separati su una colonna cHiPLC, 3 µm, Chrom XP C18CL, 120 Å, 15 cm × 75 µm (Eksigent) a 300 nl/minuto di flusso, utilizzando un gradiente lineare: 5-60% di solvente B in 80 minuti, 60-90% per 2 minuti. La colonna è stata rigenerata mediante lavaggio con solvente B al 90% per 6 minuti e riequilibrata con solvente B al 5% per 22 minuti.

Lo spettrometro di massa era accoppiato a una Nano Spray Ion Source (AB Sciex), controllata dal software Analyst (v.1.6). La sorgente ionica era dotata di un emettitore PicoTip SilicaTip da 10 μm (AB Sciex) e i peptidi eluiti sono stati monitorati dai seguenti parametri della sorgente ionica-IHT = 130°, ISVF = 2100 v, GS1 = 20, curtain gas = 25. Lo spettrometro di massa è stato utilizzato in modalità di acquisizione dipendente dalle informazioni (IDA) top10 e modalità ad alta sensibilità con 500 e 200ms tempo di accumulo per le scansioni MS1 e MS2, rispettivamente, e 12 s esclusione dinamica, con un conseguente duty cycle totale di ~ 2,55 s. Analisi spettrometro di massa è stata eseguita utilizzando TOF-MS1 e MS2 indagine scansioni che vanno da 350-1250 e 140-1600 m / z, rispettivamente. L’energia di collisione rotolamento è stato controllato automaticamente da IDA rotolamento energia parametro script collisione. Criteri di selezione per lo ione genitore da frammentare incluso intensità-dove gli ioni dovevano essere maggiore di 150 cps, tolleranza di massa di 50mDa, con uno stato di carica di +2 a +5. Una calibrazione automatica degli spettri è stata fatta dopo l’acquisizione di ogni 2 campioni utilizzando dinamiche LC-MS e acquisizioni MS/MS di 25fmol β-galattosidasi.

L’elaborazione dei dati e l’analisi

L’acquisizione MS-MS di Akt1 e dei suoi partner proteici interagenti è stata mediata in 3 diverse fasi del ciclo cellulare cioè G0, G1/S e G2. Le cellule etichettate SILAC che rappresentano ogni fase sono state raggruppate in tre set separati e analizzate come replicati biologici. L’acquisizione di ogni replicato biologico ha prodotto 2 file wiff e 2 file wiff.scan, che rappresentano i suoi replicati tecnici. I file Wiff sono stati nuovamente raggruppati per ogni replicato biologico prima della ricerca contro UniProtKB/SwissProt Human database (rilascio aprile 2015) utilizzando il software protein pilot, versione 4.5 (revisione no.1656). Il database di riferimento consisteva di 20.204 voci di proteine nel rilascio specificato. La ricerca di protein pilot si è basata sull’algoritmo paragon, una parte delle statistiche di default del software. Le seguenti impostazioni sono state utilizzate per le ricerche paragon – (a) Specie come Homo sapiens, (b) Lys C e tripsina come categorie di enzimi per le diverse corse, (c) Massimo mancate scissioni = 2, (d) modifiche fisse come etichette SILAC-K6R6 e K8R10; cisteina alchilazione da metanethiosulphonate (MMTS), (e) modifiche variabili come ossidazione alla metionina, che è un’opzione predefinita nel pilota della proteina, (f) identificazione, SILAC (Lys + 6, Arg + 6) e SILAC (Lys + 8, Arg + 10) come tipi di campione, e (g) parametro “Search Effort” “Thorough ID”, che ci dà una vasta ricerca di varie modifiche della proteina, (h) tolleranza di massa per gli ioni precursore e frammento erano 0.05 e 0.1 Da, rispettivamente. Per ogni replica biologica per etichetta SILAC sono stati generati i file Lys C e Trypsin digeriti. I seguenti parametri sono stati impiegati per filtrare i dati al fine di ottenere un set di dati sicuri per la successiva analisi-(a) algoritmo di correzione automatica Bias per il rapporto pesante alla luce è stato applicato. Esso corregge la miscelazione ineguale durante la combinazione dei diversi campioni etichettati in un esperimento e rimuove qualsiasi bias sperimentale o sistematico. Il fattore auto bias aumenta l’accuratezza della quantificazione normalizzando le variazioni nelle quantità iniziali della proteina45, (b) Proteine a 1% Global false discovery rate (FDR) da fit (G-FDR-fit) sono stati mantenuti. L’analisi FDR è stata eseguita utilizzando Proteomics Performance Evaluation Pipeline Software (PSPEP) che è installato con il software pilota proteina; (c) soglia minima proteina fiducia cutoff è stato impostato al 95%; (d) Identificazione di almeno un peptide unico con 95% di fiducia attraverso tutti e tre replicati.

Liste di proteine acquisite dopo Lys C e digestione tripsina sono stati messi in comune per replicato biologico. I rapporti di quantificazione tra le proteine etichettate SILAC medie e pesanti rispetto alle loro controparti più leggere sono stati mediati. Successivamente, abbiamo ottenuto tre liste di proteine per SILAC label-K0R0, K6R6 e K8R10. Questo è stato seguito dalla preparazione di una lista di unione delle proteine identificate; La stima quantitativa è stata curata manualmente unendo i file di tre replicati biologici per ogni condizione SILAC. Le proteine che sono state identificate in tutti e tre i set di repliche sono state mantenute per l’analisi successiva e i rapporti quantitativi tra le etichette medie e pesanti rispetto alle etichette leggere per queste proteine sono stati mediati. Un file finale combinato è stato quindi preparato per K0R0 (fase G0), K6R6 (fase G2) e K8R10 (fase G1/S). Una proteina si è qualificata per essere nella lista finale degli interagenti Akt1 solo se è stata identificata in tutti e 3 i set di repliche per qualsiasi fase del ciclo cellulare. Proteine che sono stati identificati ma non quantificato in tutte e tre le repliche sono stati assegnati un valore di quantificazione di 0,01 (minimo) o 100 (massimo) dopo l’intrusione nel peptide SILAC rapporti.

Per potare l’elenco di Akt1 interagenti ulteriormente di qualsiasi interazioni non specifiche con matrice di affinità o tag di per sé, SH tagged GFP è stato sovraespresso in cellule HEK293. Partner interagenti della proteina GFP sono stati selettivamente eluiti come descritto per i complessi proteici Akt1. Le proteine che si sono sovrapposte all’interactome specifico della fase del ciclo cellulare di Akt1 sono state rimosse dalla lista degli interagenti di Akt1 come proteine non specifiche. Questo alla fine ci ha dato un dataset sicuro per i partner di interazione per Akt1. Un riassunto delle informazioni sulle proteine interagenti Akt1 e le loro stime di quantificazione è fornito nella tabella supplementare 3. Dividendoli con quello del rapporto Akt1 in fase rispettiva normalizzato rapporti quantitativi per tutti gli interagenti Akt1. Questo ha dato uniformità a Akt1 come 1 nelle fasi G0, G1/S e G2.

Poliacrilammide Gel Electrophoresis e Western blotting

Dalla lista degli interagenti Akt1 identificati, CDK1, CCNB1, BUB3, API5 e SH3PX1 sono stati selezionati a caso per convalidare la loro associazione con Akt1 da western blotting. Il pellet di cellule che esprimono Akt1 asincronizzato è stato lisato in tampone IP e sottoposto a purificazione di affinità mirando al tag SH come descritto in precedenza. Gli eluati sono stati raggruppati e diluiti in tampone 1X SDS campione e riscaldato per 10 minuti e risolto su 10% SDS-PAGE. Le bande proteiche sono state trasferite su una membrana di nitrocellulosa e quest’ultima è stata bloccata utilizzando un tampone di blocco 1:1 odyssey: PBS per un’ora a temperatura ambiente. Successivamente, la membrana è stata tagliata per consentire alle proteine di diverse dimensioni di essere sondate con i rispettivi anticorpi primari da convalidare insieme all’anticorpo anti-HA. La diluizione dell’anticorpo primario è stata fatta in tampone odyssey: PBST e incubato per una notte a 4 °C su un agitatore. Dopo un accurato lavaggio i blot sono stati esposti ai rispettivi anticorpi secondari anti-mouse o anti-rabbit marcati IR ad una diluizione di 1:15000; diluiti in tampone odyssey: PBST. Le bande sono state rilevate utilizzando odyssey scanner a infrarossi.

Coimmunoprecipitazione inversa è stato fatto anche utilizzando Dynabeads proteina A. Gli interagenti Akt1 precedentemente rilevato sono stati utilizzati come proteine esca e Akt1 è stato sondato come loro partner di interazione utilizzando anticorpo anti-Akt1. Gli anticorpi contro gli interagenti Akt1 selezionati sono stati miscelati con 50 µl di dynabeads in provette separate ad una concentrazione di 1:20-1:70; diluiti in 200 µl di PBST. Le miscele bead-anticorpo sono state tenute in incubazione a temperatura ambiente per 10 minuti. I complessi microsfera-anticorpo sono stati pellettati usando un separatore magnetico e risospesi in 200 µl di PBST per il lavaggio. Successivamente, 250 µl di lisato sono stati aggiunti a ciascuna provetta e tenuti in incubazione a 4 °C per 2 ore su un agitatore rotante. Le microsfere con i rispettivi complessi anticorpo-antigene sono state nuovamente pellettate e lavate tre volte con 200 µl di PBST per lavaggio. Poi le perline sono state bollite in 50 µl di tampone campione 1X SDS per 10 minuti e successivamente raffreddate. Il surnatante è stato caricato su SDS-PAGE al 10% e analizzato mediante western blotting. L’anticorpo anti-Akt1 è stato usato per cercare Akt1 nell’eluizione di API5, CCNB1, CDK1, BUB3 e SH3PX1.

GO Classificazione

Le classiGO che descrivono la funzione di ogni interagente Akt1 sono state determinate da UniProt (http://www.uniprot.org/) e dai database EnrichR (http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/). Dopo un’estesa cura manuale, gli interagenti Akt1 identificati sono stati segregati in 3 classi funzionali principali, cioè proliferazione e sopravvivenza, metabolismo e sintesi proteica. Il resto è stato rappresentato come una classe comune chiamata ‘altri’ che includeva proteine con funzioni come il trasporto, l’emopoiesi, ecc.

Gene Knockdown usando siRNA

Standardizzazione

Per determinare la concentrazione ottimale di siRNA per la trasfezione, 1,2 × 105 cellule HEK293 sono state seminate in una piastra da 12 pozzetti. siRNA contro PLK1 è stato usato come controllo positivo in tutti i test di knockdown. Una gamma di concentrazioni di siRNA da 10 nM a 50 nM è stata trasfettata utilizzando il reagente di trasfezione dharmafect, come da protocollo del fornitore. I cambiamenti nei livelli di espressione proteica sono stati monitorati da western blotting a 24 ore, 48 ore e 72 ore, rispettivamente (Figura 2 supplementare). Pochi altri obiettivi (SH3PX1, AKT1, CCNB1 e SLC25A5) sono stati abbattuti e l’effetto dell’abbattimento è stato determinato mediante western blotting. GAPDH è stato usato come controllo di carico.

Knockdown delle proteine bersaglio

Le proteine che mostrano un’associazione perturbata con Akt1 mentre la cellula progredisce dalla fase G0 alla G1/S del ciclo cellulare sono state abbattute individualmente in cellule HEK293 e studiate tramite FACS. Ogni siRNA è stato risospeso in 1x siRNA buffer per ottenere una concentrazione stock di 20 µM. La trasfezione è stata mediata in triplicati 24 ore dopo la semina delle cellule; insieme ad appropriati controlli positivi e negativi. Ogni siRNA è stato diluito ad una concentrazione di lavoro di 25 nM in RPMI per fare un volume finale di 50 µl e tenuto a temperatura ambiente per 5 minuti di incubazione. Allo stesso modo, il reagente di trasfezione è stato anche diluito in RPMI per fare un volume di 50 µl e tenuto per l’incubazione in condizioni simili. Sia il siRNA che il reagente di trasfezione sono stati mescolati delicatamente per formare complessi e hanno continuato l’incubazione per altri 20 minuti a temperatura ambiente. Il volume finale è stato portato a 500 µl con media contenente 10% di siero. Questi complessi sono stati poi aggiunti delicatamente sulle cellule e hanno continuato l’incubazione a 37 °C. I mezzi di coltura delle cellule sono stati sostituiti con mezzi freschi al 10% dopo 24 ore. Infine, 48 ore dopo la trasfezione, l’efficienza della trasfezione è stata determinata monitorando siGLO al microscopio invertito Nikon Ti.

Acquisizione e analisi FACS

A 48 ore dalla trasfezione, le cellule sono state brevemente centrifugate e i media sono stati aspirati. Le cellule sono state colorate con 300 µl di soluzione di ioduro di propidio contenente 0,1 mg/ml di ioduro di propidio (Sigma), 3 µl/ml di Triton-X 100 (Sigma), 1 mg/ml di citrato di sodio (Sigma) e 20 µg/ml di RNasi (Sigma) per 30 minuti a 4 °C. Le cellule colorate sono state immediatamente trasferite in tubi BD FACS e acquisite in BD FACS Canto.

I dati ottenuti sono stati analizzati utilizzando il software FlowJo. Gli istogrammi del DNA sono stati analizzati per quantificare le popolazioni sub G0, G0/G1, S e G2/M. Piccoli spostamenti sono stati osservati nelle popolazioni G0/G1 e G2/M e quindi il gating manuale è stato fatto per analizzare queste popolazioni.

PDT e calcolo RT

PDT e RT nelle fasi G1, S e G2 del ciclo cellulare sono stati calcolati dopo il knockdown siRNA dell’insieme di proteine che mostrano un’associazione disturbata con Akt1 nella fase G1/S. La PDT per i 23 geni, insieme ai controlli, è stata monitorata in cellule HEK293 per 72 ore. Brevemente, 10.000 cellule sono state seminate in una piastra a 96 pozzetti, in 100 µl di media RPMI con 10% di siero. La trasfezione siRNA è stata mediata il giorno successivo in triplicato per ogni proteina bersaglio ed è stata considerata come punto temporale di 0 ore. Il conteggio delle cellule è stato determinato per le cellule HEK293 non trattate con il metodo di colorazione blu trypan. Dopo 24 ore, i mezzi di coltura cellulare contenenti complessi di siRNA sono stati sostituiti con RPMI fresco contenente 10% di siero. Successivamente, le cellule sono state contate per ciascuna delle cellule trasfettate con siRNA per rappresentare il punto temporale di 24 ore. In seguito, una serie di cellule, in coltura parallela, sono state raccolte e contate rispettivamente a 48 ore e a 72 ore.

Una volta determinata la PDT per tutto il set mirato di geni perturbati, la RT (in ore) per ciascuno è stata calcolata per la fase G1, S e G2 come segue:

where; % della popolazione di cellule sono state determinate dall’acquisizione FACS.

Data Availability

I dati della spettrometria di massa sono stati depositati come dataset “Defining the Akt1 interactome and delineating alterations in its composition as a function of cell cycle progression.” a ProteomeXchange tramite il database PRIDE. È pubblicamente disponibile tramite ProteomeXchange con l’identificatore ProteomeXchange: PXD005557. Il set di dati consiste di 12 file grezzi (wiff e wiff.scan) e 18 file associati di proteine pilota.