6.2.3 Cowpea Mosaic Virus

Cowpea mosaic virus (CPMV; Comovirus, Comoviridae) è la piattaforma più ampiamente studiata per varie coniugazioni e applicazioni biotecnologiche. È un virus icosaedrico di 30 nm e consiste in un genoma di RNA bipartito a senso positivo e a singolo filamento, con ogni molecola di RNA incapsulata in una particella separata. Il capside del CPMV è composto da 60 copie ciascuna di due diverse subunità CP (denominate piccole, 24 kDa, e grandi, 42 kDa) con simmetria icosaedrica pseudo T = 3. A causa della presenza della natura altamente simmetrica ed eteromerica del capside, CPMV fornisce una notevole opportunità di introdurre differentemente (a cinque volte o tre volte o entrambe le posizioni) molteplici tipi di funzionalità mediante ingegneria genetica e chimica specifica con controllo sia sulla distribuzione spaziale e il grado di multivalenza (Uchida et al., 2007; Young et al., 2008; Steinmetz, 2010; Wen et al., 2016). CPMV può essere purificato in grandi quantità da foglie infette ed è stabile in un’ampia gamma di temperature (fino a 60°C) e nell’intervallo di pH 3.0-9.0 e può resistere ad alcuni solventi organici (Steinmetz et al., 2009). I capside di CPMV sono utilizzati per l’immobilizzazione controllata di enzimi attivi. L’utilizzo del capside CPMV per la fabbricazione temporizzata di nanoparticelle metalliche attraverso una deposizione elettrochimica (ELD) e la mineralizzazione attraverso una varietà di processi ha permesso la produzione di strati sottili di metalli e leghe con spessore e composizione uniformi. I virioni CPMV sono utilizzati come blocchi di nano-costruzione per la costruzione controllata di strutture 2-D e 3-D utilizzando un approccio bottom-up, layer-by-layer (LbL) per potenziali applicazioni come dispositivi nanoelettronici o biosensori elettrochimici multipli (rivisto in Culver et al., 2015; Wen et al, 2015a, 2016; Narayanan e Han, 2017a).

Particelle CPMV native e CPMV derivatizzate con complessi metallici lantanidi sono stati trovati per essere sicuro e non tossico, sulla base della biodistribuzione, tossicità e studi patologici di queste particelle in vivo (Rae et al., 2005; Singh et al., 2007). CPMV è stato trovato per essere associato con regioni di infiammazione e indotto la rottura della barriera emato-encefalica durante il sistema nervoso centrale (CNS) infezione nei topi (Shriver et al., 2009). CPMV con PEGylation di superficie ha mostrato una bassa immunogenicità, e l’internalizzazione è stata impedita in diversi tipi di cellule a causa della riduzione del legame non specifico (Raja et al., 2003). Manchester e collaboratori hanno scoperto che il CPMV marcato fluorescentemente ha una capacità endogena di essere assorbito dalle cellule endoteliali vascolari e può essere usato come una sonda di imaging intravitale per visualizzare la vascolarizzazione e il flusso sanguigno ad una profondità fino a 500 μm per 72 ore in embrioni di topo e pulcino viventi (Lewis et al., 2006). Si è scoperto che CPMV ha una capacità naturale di legarsi alla vimentina di superficie, una proteina citoscheletrica che modula l’architettura e la dinamica delle cellule, ed è stata trovata sovraespressa in cellule endoteliali, tumorali e infiammatorie (Koudelka et al., 2009). Il biocompatibile, l’interazione naturale con vimentina e le caratteristiche di ritenzione dell’endotelio di CPMV è stato ulteriormente sfruttato per l’immagine di angiogenesi tumorale e homing tumorale in vivo (Leong et al., 2010; Steinmetz et al., 2011; Yildiz et al., 2011; Wen et al, 2015a).

La superficie esterna del capside del CPMV è stata ampiamente modificata utilizzando lisina, cisteina, tirosine e residui di acido aspartico e glutammico esposti in natura o geneticamente modificati utilizzando metodi di coniugazione chimica standard e reticolanti coniugati per attaccare diversi reagenti come nanoparticelle di Au, redox reattivo methyl viologen moieties, organometallic ferrocene carboxylate moieties, fluorofori, biotina, catene PEG, derivati stilbene, carboidrati, proteine eterologhe (ad es.g., l’olo-transferrina umana, il lisozima T4, il domian LRR dell’internalina B e il prodotto del gene Intron 8 del recettore tirosin-chinasico HER2), anticorpi, oligonucleotidi, punti quantici semiconduttori e fullereni. L’incorporazione di aminoacidi innaturali nel capside di CPMV è stata effettuata attraverso molteplici chimiche ortogonali (come la strategia di legatura chemoselettiva dell’idrazone e la cicloaddizione azide-alchilene catalizzata dal rame (CuAAC) o reazione “click”). Questi sforzi hanno facilitato l’uso di particelle CPMV come sonde ottiche, candidati vaccini e nanodispositivi di memoria e sensori (rivisti in Young et al., 2008; Destito et al., 2009; Grasso e Santi, 2010; Steinmetz, 2010; Lomonossoff e Evans, 2011; Wen et al., 2015a; Zhang et al., 2016; Lee et al., 2016b; Narayanan e Han, 2017a). CPMV e TMV sono stati caricati per trasportare agenti di contrasto per la risonanza magnetica (MR) e l’imaging ottico a doppia modalità, ed entrambe le modalità hanno dimostrato la specificità del legame alla fibrina in vitro con la presenza di peptidi di targeting. Studi preclinici in un modello di lesione fotochimica dell’arteria carotidea di trombosi hanno confermato l’homing del trombo delle nanosonde, con le aste allungate TMV che esibiscono un attaccamento significativamente maggiore ai trombi rispetto alle CPMV icosaedriche (Wen et al., 2015b,c). CPMV decorato con peptidi E7p72 (peptide ad alta affinità epidermico fattore di crescita-come il dominio 7 (EGFL7) vincolante che mira specificamente alle cellule endoteliali umane) mirato a neovasculature associate al tumore con alta specificità come valutato da imaging intravitale (Cho et al., 2017).

I protocolli di assemblaggio in vitro e in vivo per CPMV subunità capside non sono ancora stabiliti bene. Questo ha limitato il suo potenziale di utilizzo come un nanocontenitore per l’incapsulamento di molecole di carico. Contenuto di acido nucleico nativo di virioni CPMV è stato utilizzato come una spugna elettrostatica per attirare agenti di imaging e molecole terapeutiche attraverso la tecnica di infusione semplice (Yildiz et al., 2013). La coespressione transitoria del precursore di CPMV (VP60) che consiste in proteine grandi e piccole fuse e la proteinasi 24K per l’elaborazione proteolitica di VP60 nelle piante ha portato a CPMV VLPs (eCPMV), che erano completamente privi di RNA (sia virus che ospite) (Saunders et al., 2009). Tali capside vuoti sono stati utilizzati per trasportare una vasta gamma di molecole di carico, come metalli, coloranti fluorescenti o farmaci (Culver et al., 2015; Wen et al., 2015a; Narayanan e Han, 2017a). Fluorofori, tag di affinità biotina, PEG, e vari peptidi sono stati selettivamente visualizzati sulla superficie interna del CPMV vuoto puntando le lisine reattive (Wen et al., 2012b). L’efficacia di eCPMV come vaccino in situ è stata dimostrata in modelli murini di melanoma metastatico, cancro al seno, cancro ovarico e cancro al colon, dove ha indotto una risposta immunitaria antitumorale innescando l’attivazione e l’infiltrazione dei neutrofili, con un conseguente profilo chemio/citochinico che porta all’attivazione dell’immunità adattativa. La maggior parte dei topi ri-allestiti con tumori sul fianco opposto ha completamente rigettato il tumore ri-allestito (Lizotte et al., 2016). La consegna intratumorale della nanoparticella magnetica (mNP) per indurre l’ipertermia e l’eCPMV in combinazione hanno migliorato l’efficacia locale e sistemica del trattamento del tumore (ritardo della crescita del tumore secondario (effetto abscopico) e resistenza al rechallenge del tumore) nei modelli di cellule tumorali di adenocarcinoma mammario del topo C3H/MTG-B e del topo C57-B6/B-16-F10 melanoma (Hoopes et al., 2017a). Utilizzando otto tumori canini spontanei (due melanomi orali, tre amelioblastomi orali e un carcinoma), Hoopes et al. (2017b) hanno dimostrato che le radiazioni ipofrazionate e l’ipertermia indotta da mNP e il trattamento eCPMV intratumorale in combinazione hanno dimostrato di suscitare risposte immunitarie potenziate.

Per utilizzare CPMV per la consegna mirata di farmaci alle cellule tumorali e per superare l’interazione naturale tra CPMV e le cellule dei mammiferi, è stata utilizzata una reazione “click” per coniugare PEG e moiety di legante folico (CPMV-PEG-FA) a CPMV. Questa coniugazione ha permesso il targeting specifico del CPMV ai recettori del folato (FRs) che esprimono le cellule HeLa e KB (Destito et al., 2007). Il targeting di CPMV alle cellule tumorali di neuroblastoma è stato ottenuto modificando geneticamente CPMV per visualizzare l’analogo del neuropeptide Y (NPY) come ligando di targeting. È stato dimostrato che il CPMV-NPY ha interagito specificamente con le cellule SK-N-MC che hanno sovraespresso il recettore Y1 (Destito et al., 2009; Ma et al., 2012). L’imaging mirato ai recettori è stato ottenuto ancorando brevi sequenze di peptidi (F56 e bombesina specifici per il recettore del fattore di crescita endoteliale vascolare-1 (VEGFR-1)) e recettori peptidi a rilascio di gastrina (GRPR), rispettivamente, a CPMV. Questi sensori basati su CPMV sono risultati specifici nel legarsi alle cellule tumorali che sovraesprimono questi recettori sulla superficie cellulare (Brunel et al., 2010; Steinmetz et al., 2011). Wen e Steinmetz (2014) hanno sviluppato un approccio bottom-up per la sintesi di nanoparticelle CPMV, dimeri e assemblaggi contenenti ligandi di targeting (peptidi RGD ciclici), e coloranti fluorescenti e hanno scoperto che la presentazione simmetrica dei peptidi RGD e la dimerizzazione delle nanoparticelle ha aumentato l’efficacia del targeting delle cellule tumorali.

CPMV è stato utilizzato con successo per la visualizzazione di diversi peptidi eterologhi per indurre la risposta immunitaria. L’immunizzazione degli animali con ciascuna delle chimere ha indotto una forte risposta immunitaria umorale che era protettiva contro la sfida del rispettivo patogeno. La visualizzazione multivalente di molecole antivirali e carboidrati su CPMV ha facilitato il loro utilizzo per applicazioni terapeutiche (Lomonossoff e Evans, 2011; Koudelka et al., 2015; Hefferon, 2017). Aljabali et al. (2013) hanno stabilito la coniugazione covalente di dox a CPMV attraverso un legame ammidico o un ponte disolfuro utilizzando residui di lisina o cisteina sulla superficie esterna del CPMV. I CPMV caricati con dox hanno esibito un effetto di uccisione cellulare più elevato rispetto al dox libero anche a bassi dosaggi. CPMV modificato con una corona di dendroni caricati negativamente è stato usato per caricare fotosensibilizzatori caricati positivamente (per la terapia fotodinamica (PDT)). Questo sistema ibrido PDT-CPMV carrier è stato efficace nell’uccidere sia le cellule di melanoma che i macrofagi in vitro (Wen et al., 2016). Per superare le tossicità non specifiche limitanti la dose del cromo trivalente (un nutriente minerale benefico), che può inibire selettivamente la proliferazione delle cellule muscolari lisce aortiche umane indotte da alto glucosio (HASMC) in vitro, Il cloruro di cromo è stato caricato nella cavità interna della CPMV tramite infusione, e le particelle CPMV caricate con CrCl3 (CPMV-Cr) risultanti hanno ridotto significativamente la proliferazione delle HASMC indotta dal glucosio e hanno presentato effetti antiaterogeni in condizioni iperglicemiche (Ganguly et al., 2016).