“Una tecnica genetica molecolare utilizzata per la manipolazione diretta, l’alterazione o la modifica dei geni o del genoma degli organismi al fine di manipolare i fenotipi è chiamata ingegneria genetica.”

O in altre parole, possiamo dire:

“L’ingegneria genetica è una tecnica che permette di modificare la composizione genetica di un organismo.”

La tecnica è spesso conosciuta come manipolazione genetica, modifica genetica o alterazioni genetiche, in senso lato è classificata come ingegneria genetica.

In questa tecnica, un DNA ricombinante viene costruito e inserito nel genoma dell’ospite utilizzando un vettore. Oppure si possono eliminare alcune sequenze mutanti da un genoma. Il primo DNA ricombinante fu costruito da Paul Berg nel 1972.

Con la tecnica dell’ingegneria genetica si possono costruire organismi geneticamente modificati che sono economicamente molto importanti per noi.

È impiegata per la produzione di specie vegetali migliorate, farmaci o proteine terapeutiche, la prevenzione di disturbi genetici ereditati e la costruzione di un organismo geneticamente modificato.

Nel presente articolo, il nostro discorso principale è l’ingegneria genetica e le sue applicazioni. Il contenuto dell’articolo è,

• Cos’è l’ingegneria genetica
  • Definizione
  • Storia
  • Tipi
  • Processo
• Applicazione dell’ingegneria genetica
• Limitazioni dell’ingegneria genetica
• Conclusione

L’uomo sta manipolando il materiale genetico di molti organismi da molto tempo. Usando l’allevamento selettivo e l’ibridazione incrociata, abbiamo creato specie di piante economicamente importanti.

Lo scopo di sviluppare l’ingegneria genetica o la tecnica di manipolazione genetica è di produrre organismi o fenotipi che ci sono utili. Le tecniche di ingegneria genetica sono utilizzate per,

• la costruzione di specie vegetali geneticamente modificate.
• Specie di piante resistenti a stress biotici e biotici.
• Specie vegetali economicamente importanti
• Organismo di valore commerciale
• Per la produzione di farmaci terapeutici
• Prevenzione di anomalie genetiche.

“Nell’ingegneria genetica, il DNA di due cellule diverse viene combinato e inserito nel genoma dell’ospite tramite vettore”. I componenti importanti degli esperimenti di manipolazione genica sono spiegati qui.

Gene di interesse: Una sequenza di DNA che vogliamo inserire nelle nostre cellule bersaglio.

Vettore: usando il DNA plasmidico come vettore, il gene di interesse viene inserito nel genoma dell’ospite. I vettori sono una sorta di veicoli che trasferiscono il materiale genetico.

Cellule bersaglio: le cellule bersaglio sono la popolazione di cellule il cui genoma vogliamo manipolare o cambiare.

Definizioni:

“Una tecnica utilizzata per inserire o eliminare un gene mutante o per manipolare il genoma di un organismo è nota come ingegneria genetica.”

Storia dell’ingegneria genetica:

Il termine ingegneria genetica fu usato per la prima volta da un romanziere di fantascienza, non da uno scienziato. Nell’anno 1951, Jack Williamson ha usato il termine “ingegneria genetica” per la prima volta nel suo romanzo “Dragon’s island”.

Poco dopo, la struttura molecolare del DNA fu scoperta da Watson e Crick, anche se gli esperimenti genetici erano popolari fin dai tempi di Mendel.

Il primo DNA ricombinante fu costruito da Paul Berg nel 1972. Nello stesso anno, Herbert Boyer e Stanley Cohen eseguirono esperimenti di trasferimento genico. Nel 1974, Rudolf Jaenisch aveva creato topi geneticamente modificati, la prima volta nella storia della genetica.

Dopo il successo di Rudolf, nel 1976 fu sviluppata la specie di pianta di tabacco geneticamente modificata o geneticamente ingegnerizzata.

Durante questo periodo (tra il 1960 e il 1990) furono scoperte la digestione di restrizione, la legatura e le tecniche simili alla PCR che misero le ali alla tecnologia dell’ingegneria genetica.

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Tipo di tecniche di ingegneria genetica:

DNA ricombinante- La tecnologia del DNA ricombinante è un tipo di tecnologia di ingegneria genetica in cui una molecola di DNA artificiale è costruita legando due DNA diversi con metodi fisici. Per questo, il gene di interesse viene inserito nel vettore plasmidico e utilizzato per esperimenti di trasferimento genico.

Gene delivering- La tecnica del gene delivering è impiegata per l’inserimento di un gene di interesse nel genoma dell’ospite.

Electrophoration, sollecitazione e trasferimento genico mediato da vettori virali, trasferimento genico mediato da liposomi, trasferimento genico mediato da trasposoni sono alcuni dei metodi usati per questo.

Gene editing- Una tecnica di gene-editing è usata per modificare il genoma in cui una sequenza di DNA indesiderata viene rimossa o un nuovo gene può essere inserito nel genoma dell’ospite. CRISPR-CAS9, TALEN e ZFN sono alcuni noti strumenti di editing genico utilizzati negli esperimenti di terapia genica.

Leggi di più: Cos’è l’editing genico e CRISPR-CAS9?

Processo di ingegneria genetica:

La tecnica di ingegneria genetica è usata per molti scopi diversi, quindi dobbiamo decidere prima lo scopo dell’esperimento. L’intero processo di ingegneria genetica può essere diviso in 5 fasi più ampie:

• Selezione e isolamento del gene candidato
• Selezione e costruzione del plasmide
• Trasformazione genica
• Inserimento del DNA nel genoma ospite
• Conferma dell’inserimento

Selezione e isolamento del gene candidato:

Il gene deve contenere una sequenza di DNA che vogliamo studiare e per questo, un gene ha alcune caratteristiche speciali. Un gene candidato dovrebbe avere un alto contenuto di GC e una sequenza di DNA meno ripetitiva.

In aggiunta a questo, il gene di interesse non deve essere troppo lungo- solo pochi kb di geni possono essere inseriti con successo. Più lungo è il gene, maggiore è la possibilità di fallimento. Il gene candidato deve avere un codone di inizio e di fine in esso. Articolo correlato: Cos’è il codice genetico?

Ora, il gene di interesse può essere isolato dal resto del DNA usando la digestione di restrizione o la reazione a catena della polimerasi.

Le endonucleasi di restrizione sono gli enzimi batterici che hanno il potere di digerire la sequenza di DNA in una posizione specifica. Usando un tipo specifico di endonucleasi di restrizione possiamo tagliare e isolare il nostro gene di interesse.

Il metodo della digestione di restrizione è spiegato nel nostro precedente articolo: Cos’è la digestione di restrizione?

Nella reazione a catena della polimerasi, utilizzando le informazioni della sequenza del gene, il gene di interesse o il gene candidato viene amplificato nel termociclatore.

La macchina, usando la reazione a catena della polimerasi fa milioni di copie di un gene di nostro interesse. Attraverso il processo di elettroforesi su gel di agarosio, il gene amplificato viene isolato.

Se il gene di interesse è ben studiato, precedentemente, allora l’informazione di un gene è accessibile nella biblioteca genetica e possiamo usarla per la sintesi artificiale di un gene di nostro interesse. (utilizzando le informazioni della biblioteca genetica, il gene può anche essere sintetizzato artificialmente)

Nella fase successiva, eseguire la purificazione del DNA, se necessario. Ora il nostro DNA è pronto per essere inserito in un plasmide.

Selezione e costruzione del plasmide:

La selezione del plasmide per l’esperimento di ingegneria genetica è uno dei passi cruciali dell’intero esperimento. Prima di selezionare il plasmide, dobbiamo capire perché il plasmide viene utilizzato negli esperimenti di trasferimento genico.

Il DNA plasmidico è un DNA citoplasmatico circolare a doppio filamento dei batteri che si replica indipendentemente.

Gli scienziati lo usano come veicolo per trasferire il gene di interesse nella posizione di destinazione nel genoma. Può trasferire in modo efficiente il gene nella posizione di destinazione. La struttura del plasmide è spiegata nella figura sottostante,

Articolo correlato: Cos’è un plasmide?

Preparazione del plasmide:

Selezionare il plasmide che si adatta al vostro esperimento.

Il plasmide deve avere l’origine della replicazione, la regione promotrice, il gene della resistenza agli antibiotici e altre sequenze importanti. Utilizzando il metodo della digestione di restrizione, viene introdotto un sito di inserzione nel plasmide al quale viene legato il nostro gene di interesse.

Utilizzando la DNA ligasi T4 come sigillante di potenza, il DNA di nostro interesse viene inserito e legato nel plasmide. Insieme al plasmide, nel DNA plasmidico viene introdotto anche un marcatore selezionabile per identificare il DNA ricombinante.

In aggiunta a questo, una regione promotrice e sequenze terminatrici sono anche incluse nel plasmide per l’effettiva espressione di un gene di nostro interesse. Un plasmide con il nostro gene di interesse e alcune altre sequenze importanti è ora definito una molecola di DNA ricombinante.

Ora il nostro DNA ricombinante è pronto per l’espressione.

Se stiamo eseguendo il clonaggio genico, il plasmide viene inserito nell’ospite batterico, per questo generalmente si usa l’E.Coli. Una volta che il batterio inizia a dividersi, anche il nostro DNA plasmidico ricombinante si replica con esso.

Ora abbiamo le copie multiple del nostro DNA plasmidico che vengono estratte utilizzando il kit di estrazione del DNA plasmidico e utilizzato per gli esperimenti di trasformazione.

Trasformazione nel genoma dell’ospite:

Il trasporto del DNA ricombinante nella cellula ricevente o nel genoma ospite è ancora un altro compito noioso e difficile. Vari metodi per l’inserimento del DNA ricombinante sono usati per vari tipi di cellule perché un unico metodo non può essere usato per tutti i tipi di cellule.

Vari metodi per la trasformazione:

Utilizzando lo stress- i batteri assorbono facilmente il DNA plasmidico utilizzando alcuni fattori di stress come il calore o la calza elettrica.

Microiniezione- un ago appuntito viene utilizzato per l’inserimento del DNA direttamente nel nucleo di una cellula, tuttavia, il metodo è meno efficace e richiede un livello superiore di competenza per questo.

Elettroporazione- uno dei migliori metodi con un grande tasso di successo è il metodo dell’elettroforesi in cui il DNA ricombinante viene inserito nel genoma dell’ospite permeabilizzando la cellula con corrente elettrica.

Abbiamo trattato un intero articolo su di esso. Leggilo qui: Elettroporazione – Una moderna tecnica di trasferimento genico.

Sonicazione – la sonicazione è ancora un altro buon metodo usato a volte nell’esperimento di trasferimento genico in cui il DNA ricombinante viene inserito nella cellula bersaglio usando onde ultrasoniche. Le onde ultrasoniche aumentano anche la permeabilità delle cellule.

Trasferimento genico mediato da liposomi – Utilizzando un rivestimento esterno artificiale simile a una cellula, noto come liposoma, il DNA ricombinante può essere inserito nel genoma dell’ospite.

Trasferimento genico tramite infezione batterica- Questo metodo è uno dei metodi popolari e usati abitualmente negli esperimenti di ingegneria genetica delle piante. Qui, la specie vegetale viene infettata con i batteri trasformati per inserire un gene di interesse.

Agrobacterium tumifecian viene utilizzato per inserire il DNA ricombinante nella cellula della pianta. Un gene di interesse è inserito nel plasmide Ti- dell’Agrobacterium. Le cellule vegetali vengono infettate da questa coltura batterica e le cellule trasformate vengono rigenerate utilizzando i metodi di coltura dei tessuti vegetali.

Chimico nel trasferimento genico- Alcuni ioni metallici, prodotti chimici e soluzioni di diversi prodotti chimici sono anche impiegati negli esperimenti di trasferimento genico, tuttavia, il tasso di successo è troppo basso rispetto agli altri metodi.

Conferma dell’inserto:

Il nostro lavoro non è ancora completato.

Ora dobbiamo conformarci, se il DNA ricombinante è inserito nella nostra cellula bersaglio o no. Per questo vengono utilizzate varie tecnologie di genetica molecolare. Nel metodo di coltura tradizionale, la presenza o l’assenza di un marcatore selezionabile è usato per differenziare le cellule trasformate da quelle non trasformate.

Anche se non è necessario per il metodo di rilevamento basato sulla PCR. Il metodo di rilevamento basato sulla reazione a catena della polimerasi è ampiamente accettato e più affidabile di altri metodi.

Il DNA viene estratto dalla cellula trasformata e amplificato utilizzando i primer complementari al nostro gene di interesse o al nostro DNA ricombinante.

Se il DNA ricombinante è presente viene sicuramente amplificato altrimenti non si ottiene nessuna amplificazione. Per la conformazione a due fattori, si prende un set di primer complementare al DNA ricombinante specifico e un set di primer complementare alla sequenza del marcatore selezionabile e si esegue la PCR multiplex.

Per validare i risultati, l’amplificazione deve essere ottenuta in entrambe le reazioni.

Ma aspetta un attimo!

Cosa succede se durante l’esperimento si verifica una mutazione nel nostro gene di interesse? Perché la PCR può solo amplificare il DNA. Dobbiamo avere informazioni sulla sequenza per individuare la mutazione.

Per questo, si usa il metodo di sequenziamento del DNA.

Il DNA viene estratto dalle cellule trasformate e il gene di interesse viene amplificato con la PCR. Ora gli ampliconi della PCR vengono utilizzati per il sequenziamento del DNA in cui, utilizzando la chimica fluorescente, viene determinata in modo ordinato la sequenza del nostro gene di interesse.

Una volta soddisfatti tutti i parametri per determinare il gene di interesse, le nostre cellule sono ora pronte per essere iniettate nell’organismo ospite o per esperimenti di coltura di tessuti.

Applicazioni dell’ingegneria genetica:

Ora veniamo al punto importante di questo argomento, “A cosa serve l’ingegneria genetica?”

L’ingegneria genetica ha un grande valore industriale e agricolo. Viene praticata in medicina, ricerca genetica, agricoltura, miglioramento delle colture e per la produzione di farmaci terapeutici.

Si usa anche nello sviluppo di organismi geneticamente modificati. Qui stiamo discutendo alcune delle importanti applicazioni dell’ingegneria genetica.

La tecnologia del DNA ricombinante è usata nel miglioramento delle colture e nello sviluppo di nuovi tratti economicamente importanti. Alcuni di questi sono:

• Resistenza agli erbicidi
• Resistenza ai virus
• Maturazione ritardata dei frutti
• Controllo dei pollini
• Sviluppo di specie vegetali tolleranti al freddo e alla siccità.

Un esempio classico è il cotone BT – uno dei tipi di specie geneticamente modificate fornisce resistenza alla pianta contro il bacillus thuringiensis.

Processo di sviluppo di specie vegetali geneticamente modificate:

Un gene di interesse è isolato dall’organismo usando la digestione di restrizione o amplificato dalla reazione a catena della polimerasi. Il DNA ricombinante è costruito inserendo un gene di interesse nel plasmide, qui si usa il plasmide T-.

Nel passo successivo, il plasmide T- viene inserito nell’agrobacterium. Nell’ultimo passo, la specie vegetale viene infettata con le cellule batteriche trasformate e messa in coltura. L’intero processo è mostrato nella figura qui sotto,

GMF- il cibo geneticamente modificato è un’altra applicazione migliore dell’ingegneria genetica in cui prodotti alimentari economicamente importanti sono costruiti usando la tecnologia del DNA ricombinante.

L’esempio classico è il pomodoro Flavr Savr, una specie di pomodoro geneticamente modificato composto dalla tecnologia RNA antisenso. Ha grandi valori economici in quanto il pomodoro GM può essere facilmente trasportato da un luogo all’altro.

Un’altra importante applicazione dell’ingegneria genetica è il cibo geneticamente modificato o geneticamente ingegnerizzato.

La qualità di alcuni prodotti alimentari come il cotone, il mais e la soia sono migliorati utilizzando l’attuale tecnologia del DNA ricombinante. Lo scopo di sviluppare colture o specie di piante geneticamente modificate è quello di renderle economicamente importanti, nutrienti, ricche di proteine, di malattie e resistenti allo stress.

Anche utilizzando l’ingegneria genetica e le tecniche di coltura dei tessuti si sviluppano specie vegetali resistenti agli insetticidi nel tabacco, nella patata, nel mais e nel cotone.

Oltre a questo, alcune piante modificate in grado di generare i propri fertilizzanti possono anche essere create utilizzando la presente tecnica di modifica genetica.

Gli organismi modello transgenici sono sviluppati per testare diversi parametri: la funzione di alcuni geni può essere determinata progettando il microrganismo transgenico e i modelli animali.

Patogeni nocivi e insetticidi possono essere distrutti usando microrganismi geneticamente modificati che sono capaci di degradare le sostanze tossiche.

Applicazioni medicinali:

Droghe a basso costo, ormoni, enzimi e vaccini sono creati utilizzando strumenti di ingegneria genetica.

Il fattore di coagulazione del sangue è il miglior esempio in cui l’enzima attivatore del plasminogeno che è capace di dissolvere il coagulo di sangue è progettato artificialmente e usato nei pazienti con malattia coronarica o attacco cardiaco.

Altri esempi sono altre due proteine terapeutiche, la somatostatina e le linfochine, che funzionano contro diverse condizioni di malattia e possono essere sintetizzate artificialmente. L’insulina è ancora un classico esempio di una proteina terapeutica progettata utilizzando la tecnologia dell’ingegneria genetica.

Un gene per l’insulina viene isolato tramite digestione di restrizione o tramite PCR e inserito nel plasmide. Il DNA plasmidico ricombinante viene immediatamente inserito nella cellula batterica o di lievito in cui il plasmide si moltiplica. Quando il microrganismo inizia a dividersi, inizia a produrre insulina artificiale.

Una grande quantità di insulina prodotta con la stessa tecnica su scala industriale. Lo schema dettagliato della produzione di insulina è mostrato nella figura qui sotto,

La produzione commerciale di insulina è iniziata dopo l’approvazione della FDA nel 1982.

Vaccini ricombinanti:

I vaccini contro il vaiolo, il virus herpes simplex e l’epatite sono prodotti utilizzando la tecnica dell’ingegneria genetica. I vaccini sono le particelle virali inattivate utilizzate per indurre una risposta immunitaria contro quel patogeno, tuttavia, la possibilità di contaminazione è alta in esso.

Utilizzando la tecnologia del DNA ricombinante gli scienziati hanno creato un tipo unico di vaccini che contiene solo il DNA per la proteina virale del mantello, quindi l’agente patogeno non può più essere attivato. Il vantaggio principale è che è più sicuro, senza contaminazione e più reattivo.

Ingegneria genetica nella terapia genica:

Utilizzando la terapia genica o la tecnica del trasferimento genico, si possono curare le malattie genetiche ereditate. La fibrosi cistica, la distrofia muscolare di Duchenne e l’anemia falciforme come le terapie geniche sono ora in fase di sperimentazione clinica finale e pronte per essere utilizzate sui pazienti.

Nella terapia genica, un gene difettoso, non funzionante o mutato viene sostituito con quello di tipo selvaggio usando la stessa tecnica spiegata sopra.

Abbiamo trattato articoli sorprendenti sulla terapia genica, leggili qui:

1. Terapia genica: Tipi, vettori, processo, applicazioni e limitazioni.
2. Che cos’è la terapia genica e come funziona?
3. Terapia genica mediata dal DNA nudo
4. Sistema Transposon della Bella Addormentata: Il futuro della terapia genica

Oltre a questo, la tecnologia dell’ingegneria genetica è anche utilizzata nella produzione di biocarburante, malattie, bioalcol e altri prodotti essenziali.

Limiti dell’ingegneria genetica:

Ci sono questioni etiche associate all’uso della terapia genica e dei prodotti dell’ingegneria genetica.

Inoltre, per fornire un valore economico al prodotto alimentare o a qualsiasi prodotto GM, i valori nutrizionali sono compromessi.

A causa dell’effetto negativo di esso, nuovi ceppi patogeni resistenti si evolvono più velocemente.

Inoltre, gli effetti collaterali della terapia genica e l’uso di virus in essa sono dannosi per l’organismo bersaglio.

La tecnologia è più costosa in quanto la terapia genica costa fino a 50.000 USD.

Conclusione:

Giocare con l’embrione o il feto è contro la legge naturale, la gente ci crede fortemente, così il cibo e i prodotti vegetali geneticamente modificati diventano sempre un centro di controversie.

Tuttavia, utilizzando strumenti di ingegneria genetica come la terapia genica e la tecnica di trasferimento genico, si possono prevenire disturbi ereditari e malattie letali come il cancro. L’uso positivo delle tecniche di ingegneria genetica può cambiare il destino dell’umanità.

Fonti:

1. Comitato del Consiglio Nazionale delle Ricerche (USA) per l’identificazione e la valutazione degli effetti indesiderati degli alimenti geneticamente modificati sulla salute umana. Sicurezza degli alimenti geneticamente modificati: Approcci alla valutazione degli effetti indesiderati sulla salute. Washington (DC): National Academies Press (USA); 2004. 2, Metodi e meccanismi per la manipolazione genetica di piante, animali e microrganismi.
2. Wallace RB. Principi di manipolazione genetica. Un’introduzione all’ingegneria genetica. Studi di microbiologia. Am J Hum Genet. 1981;33(4):652-653.