Abstract

Sono stati condotti pochi studi sulla flora medica della penisola messicana dello Yucatan alla ricerca di nuovi agenti terapeutici, in particolare contro il cancro. In questo lavoro, abbiamo valutato il potenziale citotossico dell’estratto di Bonellia albiflora, una pianta utilizzata nella medicina tradizionale Maya per il trattamento delle lesioni croniche della bocca. Abbiamo effettuato gli estratti metanolici di diverse parti della pianta mediante estrazione con l’attrezzatura Soxhlet. Abbiamo condotto frazioni liquido-liquido su ogni estratto con solventi di polarità crescente. Tutti gli estratti e le frazioni sono stati valutati per l’attività citotossica contro quattro linee cellulari di cancro umano e una linea cellulare normale attraverso un saggio di riduzione del colorante tetrazolio (MTT) in piastre di coltura cellulare a 96 pozzetti. L’estratto metanolico di corteccia di radice possedeva un’attività citotossica molto maggiore nella linea cellulare del cancro orofaringeo umano (KB); la sua frazione esanica concentrava i metaboliti attivi e induceva l’apoptosi con l’attivazione delle caspasi 3 e 8. I risultati dimostrano il potenziale citotossico della frazione esanica di B. albiflora e sostanziano l’importanza dello studio delle piante medicinali tradizionali maya.

1. Introduzione

La medicina tradizionale è una pratica che è stata portata avanti dall’antichità ai nostri giorni dagli abitanti dei pueblos indigeni del Messico, tra i quali è inclusa la popolazione Maya della penisola dello Yucatan in Messico. Nella medicina tradizionale maya, le piante hanno una grande importanza, il che può essere considerato come una prova della loro efficacia per il controllo di molti tipi di malattie. Allo stesso modo, costituiscono una delle alternative più importanti per l’assistenza sanitaria, soprattutto nelle comunità in cui i servizi sanitari primari non sono accessibili. Inoltre, possono essere ampiamente sfruttati come risorsa naturale rinnovabile. Insieme a quanto descritto in precedenza, la medicina tradizionale dei pueblos indigeni è stata riconosciuta dall’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), che ha provocato una forte spinta verso la ricerca sulle piante medicinali.

La letteratura etnobotanica maya nella sua maggioranza è composta da studi storici o descrittivi, nel cui contenuto predomina un compendio di malattie e trattamenti conosciuti dai guaritori maya di epoche diverse. Il popolo Maya conosceva e curava diverse malattie, comprese quelle di origine infettiva (infezioni intestinali, dermatiti infettive e infezioni respiratorie), malattie croniche (asma, affaticamento, nefrite e ipertensione) e malattie di tipo psicologico (insonnia, nervosismo e isteria). Inoltre, curavano altre malattie come le seguenti: ascessi, calli, calli, protuberanze dure, polipi, tumori e verruche o piaghe, generalmente tangibili o visibili sulla pelle.

Nella medicina tradizionale maya della penisola dello Yucatan, il “cancro” è conosciuto come una malattia o un insieme di malattie che possono manifestarsi come un’affettazione della pelle o della massa muscolare subadiacente, o un’affettazione sotto forma di dolore in qualche organo interno. Il termine allude a una malattia difficile da curare o con un aspetto sgradevole (quando colpisce la pelle); se si tratta di un cancro interno, l’aspetto del paziente rivela la malattia. Gli antichi abitanti assegnavano dei nomi nella lingua maya a questo insieme di sintomi; nella lingua maya, il “cancro” è conosciuto come “tsunuz” o “tsunuztacan”, e le protuberanze dure o i tumori sono conosciuti come “chu’uchum”.

Studi precedenti hanno dimostrato che gli estratti di piante utilizzate nella medicina tradizionale maya per il trattamento dei segni e sintomi suggestivi del cancro possiedono attività citotossica. Allo stesso modo, due studi condotti su due specie del genere Bonellia (Bonellia macrocarpa e Bonellia flammea) della penisola dello Yucatan rivelano la presenza di nuovi composti, come agenti attivi con attività anticancerogena. In questo contesto, la penisola dello Yucatan ha cinque specie del genere Bonellia, tra cui le specie B. macrocarpa, B. flammea, e B. albiflora sono impiegate nella medicina tradizionale Maya per il trattamento delle afflizioni di tipo dermatologico. Di queste tre specie, solo B. albiflora non è stata oggetto di alcuno studio fitochimico o di attività biologica. B. albiflora è denominata “Si’ik” nella medicina tradizionale maya ed è utilizzata come antitussivo per il trattamento delle ferite della pelle e della bocca e per alleviare il dolore del mal di denti. In questo lavoro, abbiamo proposto una valutazione del potenziale citotossico degli estratti organici di B. albiflora.

2. Materiali e metodi

2.1. Materiale vegetale

Bonellia albiflora (Lundell) B. Ståhl e Källersjö è stata raccolta da diverse località dello Stato dello Yucatan, Messico, durante l’estate del 2010. Il materiale vegetale è stato identificato e autenticato dai tassonomisti del Dipartimento delle Risorse Naturali del Centro di Ricerca Scientifica dello Yucatan (CICY).

2.2. I prodotti chimici

Il mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM), il siero fetale bovino inattivato al calore (FBS), la penicillina e la streptomicina (PS) sono stati acquistati da Gibco, Carlsbad, CA, USA. Il bromuro di 3-(4-5-dimetiltiazolo-2-ile)-2,5-difenil tetrazolio (MTT), il dimetilsolfossido (DMSO), e l’etoposide sono stati acquistati da Sigma, St. Louis, MO, USA. I kit per il test della caspasi e il kit di laddering del DNA apoptotico sono stati acquistati da BioVision Research Products, Palo Alto, CA, USA.

2.3. Estrazione e frazionamento

Ogni parte vegetale è stata separata, essiccata e polverizzata. La polvere secca del materiale vegetale separato (100 g) è stata estratta in modo esaustivo utilizzando un apparato Soxhlet a 60°C di temperatura con metanolo (500 mL). I surnatanti sono stati filtrati ed evaporati sotto vuoto con un rotaevaporatore per ottenere un estratto secco. L’estratto di metanolo di ogni materiale vegetale (10 mg) è stato sospeso in 20 mL di metanolo : acqua (1 : 3) ed estratto successivamente con 50 mL di solventi di polarità crescente: esano, diclorometano e acetato di etile, in modo che l’estratto finale residuo fosse una frazione acquosa. L’impronta digitale dell’estratto esanico attivo (5 mg) è stata ottenuta per la gascromatografia-spettrometria di massa (GC-MS).

2.4. Linee cellulari e cultura

Linee cellulari di carcinoma orofaringeo (KB ATCC-CCL-17), carcinoma laringeo (Hep-2), adenocarcinoma della cervice (HeLa ATCC-CCL-2), e carcinoma squamoso della cervice (SiHa ATCC-CCL-35) così come una linea cellulare normale, rene a cellule canine (MDCK ATCC-CCL-34), dall’American Type Culture Collection (ATCC) sono state gentilmente fornite da Veronica Vallejo-Ruíz dell’East Biomedical Research Center-IMSS. Le cellule sono state coltivate in terreno DMEM, contenente 10% SFB integrato con 100 unità/mL di penicillina G e 100 μg/mL di streptomicina in 5% CO2-95% aria umidificata a 37°C.

2.5. Saggio di citotossicità

La citotossicità è stata determinata dal saggio MTT secondo il metodo descritto da Denizot e Lang con alcune modifiche. In breve, le cellule vitali di ogni linea cellulare sono state seminate in una piastra a 96 pozzetti e incubate per 24-48 ore. Quando le cellule hanno raggiunto >70% di confluenza, il mezzo è stato sostituito e le cellule sono state trattate con l’estratto sciolto in DMSO (concentrazione massima di 0,05%) a 2,34-300 g/mL. Dopo 48 ore di incubazione, 10 μL di MTT (5 mg/mL) sono stati aggiunti ad ogni pozzetto e incubati a 37°C per 4 ore. Il mezzo è stato rimosso e il precipitato di formazan è stato dissolto in 100 μL di isopropanolo acidificato (0,4 N HCl). La densità ottica è stata determinata con uno spettrofotometro a 540 nm. Le cellule trattate con 0,05% DMSO e docetaxel sono state usate come controlli negativi e positivi, rispettivamente. La concentrazione dell’estratto che ha ucciso il 50% delle cellule (CC50) è stata calcolata dal software GraphPad Prism 4.00. Tutte le determinazioni sono state eseguite in triplicato. La linea cellulare MDCK è stata utilizzata per valutare l’indice selettivo (SI) degli estratti. L’SI è definito come il rapporto tra l’attività citotossica delle linee cellulari normali e quelle cancerose.

2.6. Analisi GC-MS

La separazione cromatografica è stata effettuata mediante analisi GC-MS su un gascromatografo Agilent, modello 6890N, accoppiato a un rilevatore selettivo di massa, modello 5975B. I composti sono stati separati su una colonna capillare DB-5 ms (30 m × 0,32 mm i.d., 0,25 μm di spessore del film) (J&W Scientific, Folsom, CA, USA). Un microlitro del campione è stato iniettato nel GC-MS usando la modalità split (50 : 1). La temperatura dell’iniettore era di 250°C. La temperatura della colonna è stata programmata come segue: temperatura iniziale a 160°C per 3 min, 10°C/min a 240°C, 240°C per 2 min, 5°C/min a 250°C, 250°C per 10 min, 5°C/min a 300°C e 300°C per 10 min. Le condizioni del rivelatore di massa erano le seguenti: modalità di impatto elettronico (EI) a 70 eV; temperatura della sorgente: 230°C; velocità di scansione: 1 scansione/s; intervallo di acquisizione di massa: 20-600 amu; ritardo del solvente, 4 min. Il gas vettore era elio a 1 mL/min. I componenti volatili sono stati identificati provvisoriamente confrontando i loro spettri di massa utilizzando il database di riferimento standard NIST versione NIST 05 per Windows. Uno standard autentico del composto bonediol è stato gentilmente fornito dal Dr. Peraza-Sánchez del CICY.

2.7. Analisi della frammentazione del DNA

La frammentazione del DNA è stata determinata secondo il metodo descritto da Tong et al. In breve, le cellule sono state trattate con l’estratto a 10 e 50 μg/mL e incubate per 6, 12 e 24 ore. Dopo l’incubazione, le cellule sono state raccolte per centrifugazione e lavate due volte in PBS ghiacciato. Un kit di laddering del DNA apoptotico (BioVision apoptotic DNA ladder extraction kit) è stato utilizzato per isolare il DNA secondo il protocollo del produttore; il DNA nei campioni è stato separato su gel di agarosio all’1,5% contenente 1 μg/mL di etidio bromuro. Le bande di DNA sono state visualizzate sotto illuminazione ultravioletta e sono state fotografate.

2.8. Le attività delle caspasi

Le attività delle caspasi 3, 8 e 9 sono state eseguite utilizzando il kit di dosaggio colorimetrico FLICE/Caspase, seguendo i protocolli del produttore. In breve, le cellule trattate con 10 o 50 μg/mL di estratto per 6, 12 o 24 ore sono state raccolte, lavate con PBS e centrifugate a 800 ×g per 10 minuti a 4°C. Il pellet di cellule è stato risospeso in 50 μL di tampone di lisi e incubato in ghiaccio per 10 min prima di essere centrifugato a 10.000 ×g per 1 min. Il surnatante è stato raccolto in una provetta da 1,5 mL e tenuto in ghiaccio. Dopo aver misurato la concentrazione proteica, 200 μg di proteina è stato sciolto in 50 μL di tampone di lisi cellulare. Il tampone di reazione con 10 mM DDT è stato aggiunto ad ogni campione. Infine, un substrato specifico per ogni caspasi (DEVD-ρNA, IETD-ρNA e LEHD-ρNA) è stato aggiunto ai campioni, incubato a 37°C per 1 ora e letto a 405 nm. L’attività enzimatica è stata espressa come piega rispetto al campione di controllo.

3. Risultati e discussione

3.1. Attività citotossica degli estratti metanolici

I risultati di citotossicità degli estratti metanolici di diverse parti di B. albiflora sono riassunti nella tabella 1. L’estratto metanolico della corteccia della radice ha mostrato l’attività citotossica più interessante rispetto agli estratti di foglie e corteccia del gambo di B. albiflora, con un CC50 di 12-31 μg/mL sulle quattro linee cellulari di cancro umano. La linea cellulare KB ha mostrato una maggiore sensibilità all’estratto con una CC50 di 12,64 μg/mL. La linea cellulare di rene canino non tumorale MDCK era meno sensibile agli effetti dell’estratto con un SI di >5 nelle linee cellulari valutate (Tabella 1). Il National Cancer Institute (NCI) degli Stati Uniti ha proposto che gli estratti grezzi con potenziale attività citotossica sono quelli che presentano una CC50 di ≤30 μg/mL; quindi, questo estratto è stato identificato come importante per studi futuri. Questi dati sono simili a quelli ottenuti negli estratti metanolici attivi di B. macrocarpa-root su linee cellulari umane: KB, adenocarcinoma della prostata (PC3), carcinoma squamoso della cervice (SiHa), adenocarcinoma della mammella (MCF-7), adenocarcinoma della cervice (HeLa), e carcinoma della laringe (Hep-2) .

L’estratto di foglie era il secondo in maggiore attività, solo sulla linea cellulare KB con una CC50 di 23.85 μg/mL secondo i criteri NCI, seguito da quello dell’estratto della corteccia dello stelo, che era meno citotossico sulle linee cellulari KB e Hep-2.

3.2. Attività citotossica delle frazioni

Gli estratti metanolici di diverse parti della pianta sono stati frazionati con solventi di polarità crescente per successivi studi di citotossicità nelle linee cellulari. La frazione esanica ottenuta dal partizionamento liquido-liquido dell’estratto metanolico della corteccia della radice (HFBa) ha presentato effetti citotossici superiori rispetto all’estratto originale, con un CC50 tra 2 e 27 μg/mL nelle diverse linee cellulari (tabella 2). Anche l’SI della frazione esanica è migliorato rispetto all’estratto originale nelle linee cellulari valutate (SI = 5-54). Le frazioni metanoliche degli estratti di corteccia e foglie non erano attive a concentrazioni di >200 μg/mL (dati non mostrati).

In precedenza, abbiamo condotto uno studio bioguidato per valutare l’attività antiproliferativa di B. macrocarpa, ottenendo l’isolamento del composto bonediol, che ha mostrato una moderata attività nelle linee cellulari tumorali. Tuttavia, il presente studio non ha mostrato effetti citotossici con HFBa paragonabili all’estratto metanolico originale nelle linee cellulari valutate (Tabella 2). Una spiegazione a questi risultati può essere che il bonediolo inibisce qualche punto della proliferazione cellulare (ciclo cellulare o replicazione del DNA), mentre gli effetti che si osservano nel saggio citotossico sono danni o tossicità generale (apoptosi o necrosi) .

HFBa ha presentato migliori effetti citotossici rispetto al bonediolo ed era più selettivo verso il tumore che verso le cellule normali; SI è considerato un indicatore di attività biologica e non è legato alla citotossicità se il SI è >10 . A questo proposito, solo HFBa ha soddisfatto questi criteri ed è stato più potente nella linea cellulare KB con un CC50 di 2,73 μg/mL; questa linea cellulare è correlata al cancro orale ed è in accordo con l’uso della pianta nella medicina tradizionale Maya per le lesioni orali croniche, un termine che potrebbe essere correlato al cancro.

3.3. Analisi GC-MS

L’identificazione e l’analisi chimica della frazione esanica bioattiva tramite GC-MS è mostrata nella tabella 3. Il cromatogramma ha rivelato un totale di otto picchi, sei dei quali sono stati identificati dal database: acido dodecanoico; acido tridecanoico; acido 2-nonil-malonico, estere dimetilico; stigmasta-7,16-dien-3-olo; 9,19-ciclo-lanost-24-en-3-olo; e bonediolo. Quest’ultimo è stato identificato dal tempo di ritenzione e dal confronto dello spettro di massa di uno standard autentico precedentemente isolato da B. macrocarpa . I principali componenti trovati sono stati i seguenti: Acido 2-nonil-malonico, estere dimetilico (37,39%), seguito da stigmasta-7,16-dien-3-olo (13,63%), acido dodecanoico (13,22%), 9,19-Ciclo-lanost-24-en-3-olo (9,90%), e bonediolo (8,98%). I componenti non identificati con tempi di ritenzione di 8,092 (6,22%) e 14,207 (5,38%), così come l’acido n-tridecanoico (5,25%), erano composti minori nella HFBa (Figura 1).

Figura 1

Cromatografia a gas di HFBa.

Bonediolo è stato isolato dall’estratto metanolico di radici di B. macrocarpa come componente bioattivo. In questo lavoro, abbiamo rilevato la presenza di questo composto ad una bassa concentrazione; quindi, potrebbe essere indicato come un possibile marcatore chemiotassonomico. Inoltre, in altre specie come B. pungens, è stato isolato un triterpene, e da B. ruscifolia, sono stati isolati due triterpeni, senza rapporti di attività biologica. In questo lavoro, abbiamo trovato solo prove della presenza di un triterpene derivato dal lanosterolo nella frazione esanica attiva. Inoltre, abbiamo rilevato uno sterolo ubiquitinato, un derivato dello stigmasterolo. A nostra conoscenza, questa è la prima volta che entrambi i composti sono stati segnalati in questo genere.

Negli ultimi anni, non solo lo studio dei composti bioattivi delle piante dal punto di vista medico è diventato più frequente, ma anche quello degli estratti vegetali stessi o la miscela di composti che insieme potrebbero dare una migliore attività biologica di quella esibita da un singolo composto è, inoltre, diventato frequente. In questo lavoro, i componenti sono descritti come il fingerprinting di HFBa eseguito da GC-MS per future standardizzazioni.

3.4. Frammentazione del DNA

Abbiamo osservato che l’estratto di metanolo delle radici di B. albiflora ha mostrato una morfologia tipica di apoptosi (dati non mostrati) sulle linee cellulari KB. Allo stesso modo, HFBa ha dimostrato di indurre la morfologia apoptotica sulle linee cellulari KB. Questi risultati ci hanno portato a valutare se la frazione esanica che ha dimostrato la maggiore citotossicità e le caratteristiche morfologiche di apoptosi nella linea cellulare KB potesse indurre questo processo; così, abbiamo valutato la frammentazione del DNA, tipica del processo di apoptosi. La frammentazione del DNA è stata registrata da minore a maggiore grandezza all’interno di un intervallo di concentrazione del trattamento di 10 o 50 μg/mL e un intervallo di tempo di incubazione di 6-24 h. La figura 2 mostra la tipica frammentazione del DNA nelle cellule KB dopo il trattamento con 50 μg/mL HFBa e un periodo di incubazione di 18 h. Diversi studi hanno dimostrato l’effetto apoptotico di alcuni estratti metanolici di piante. Tuttavia, pochi studi hanno indagato le caratteristiche chimiche dei composti che possono possedere questa attività. In quei pochi studi, è stato generalmente trovato che le frazioni organiche a bassa polarità sono responsabili dell’effetto apoptotico sulle linee cellulari, coincidendo con i risultati ottenuti in questo studio.

Figura 2

Effetto dell’estratto esanico di radice Bonellia macrocarpa sulla frammentazione del DNA nelle cellule KB. Dopo il trattamento delle cellule con una concentrazione di 50 μg/mL di B. macrocarpa per 12 ore, il DNA è stato isolato e separato su gel di agarosio all’1,5%. Il DNA è stato colorato con bromuro di etidio e visualizzato sotto la luce UV. Corsie da 1 a 4: corsia 1 (controllo negativo): DNA raccolto da cellule KB non trattate dopo 18 ore; corsia 2 (controllo positivo): DNA raccolto da cellule KB trattate con 50 μg/mL di etoposide dopo 18 ore; corsia 3: DNA raccolto da cellule KB trattate con 50 μg/mL di estratto dopo 18 h; corsia 4: Marcatore del peso molecolare del DNA.

Non è noto se i composti presenti in HFBa siano responsabili dell’induzione dell’apoptosi, ma essa non può essere attribuita ad un singolo composto come il bonediolo che, sebbene presente nell’estratto, richiede alte concentrazioni per indurre l’apoptosi (dati non mostrati), a differenza di HFBa, che induce la frammentazione del DNA a 10 μg/mL. Per quanto riguarda quanto sopra, oltre al bonediolo, segnaliamo la presenza di acido dodecanoico e un derivato dello stigmasterolo come componenti di HFBa. Questi composti sono stati associati all’attività citotossica osservata per la frazione esanica del Crocus sativus . Inoltre, alcuni autori hanno dimostrato che i derivati dello stigmasterolo hanno mostrato una significativa attività citotossica in linee cellulari tumorali che dipendevano dall’apoptosi. In particolare, lo spinasterolo (stigmasta-7, 22-dien-3beta-ol) ha dimostrato una ridotta incidenza di tumori della pelle in vivo. Infatti, lo spinasterolo e il derivato riportato in questo studio differiscono per il doppio intreccio in posizione 22 nello spinasterolo e in posizione 16 per il derivato dello stigmasterolo. Forse, lo stigmasta-7, 22-dien-3beta-ol potrebbe contribuire all’attività citotossica osservata in questo studio. Inoltre, è noto che i lanostani sono un gruppo di triterpenoidi tetraciclici derivati dal lanosterolo, che hanno molteplici attività contro le cellule tumorali tra cui l’induzione dell’apoptosi. È possibile che i composti di tipo lanostano e stigmasterolo riportati nella frazione attiva dell’esano abbiano un grado di attività citotossica e un effetto di induzione dell’apoptosi. È probabile che diversi composti presenti nella frazione esanica agiscano sinergicamente per indurre citotossicità e apoptosi.

3.5. Analisi dell’attività delle caspasi

Per sapere se il meccanismo di attivazione della frammentazione del DNA era indotto dall’attivazione dell’apoptosi attraverso la via intrinseca o estrinseca, abbiamo valutato l’attività delle caspasi che è caratteristica di ciascuna. I periodi di incubazione erano di 2, 4, 6 e 12 ore per ottenere un profilo di attivazione. La caspasi 8 è stata attivata dopo 6 ore di trattamento con 50 μg/mL di HFBa; l’aumento era tre volte maggiore rispetto alle cellule di controllo senza trattamento (controllo negativo) (Figura 3). Nessun aumento è stato osservato nell’attivazione della caspasi 8 nei periodi di incubazione di 2, 4 e 12 ore. La caspasi 9 non è stata attivata nelle cellule KB dopo il trattamento con 50 μg/mL di HFBa durante 2-12 h, il che suggerisce una mancanza di attivazione dell’apoptosi da parte della via intrinseca (Figura 4). L’attività della caspasi 3 è aumentata di quattro volte rispetto a quella del controllo nelle cellule trattate con HFBa, che è in accordo con l’attivazione della caspasi 8 (Figura 5). L’aumento dell’attività della caspasi 8 è tipico dell’attivazione della via estrinseca dell’apoptosi, che a sua volta attiva altre procaspasi, tra queste la caspasi 3, che a sua volta porta alla degradazione delle proteine nucleari come la laminina A, la fodrina, l’actina e la gelsolina. Porta anche al rilascio dell’inibitore della proteina DNasi attivata dalla caspasi (ICAD), convertendolo nell’enzima DNasi attivata dalla caspasi (CAD), il cui obiettivo è la degradazione del DNA, come illustrato nella figura 2. Dato che la caspasi 9 non è stata attivata, concludiamo che B. albiflora induce l’apoptosi attraverso la via estrinseca. Questo evidenzia il grande potenziale che questa frazione possiede come terapia alternativa o aggiuntiva nel trattamento del cancro. In letteratura ci sono diversi studi su estratti di piante e sui loro effetti sull’induzione della via intrinseca dell’apoptosi. Tuttavia, pochi studi hanno dimostrato l’attivazione della via estrinseca dell’apoptosi da parte di estratti di piante; per esempio, l’estratto metanolico di Paeonia suffruticosa induce l’apoptosi nella linea cellulare umana del cancro allo stomaco (AG3), e l’estratto di radice di dente di leone ha la capacità di indurre l’apoptosi nella linea cellulare della leucemia mielomonocitica cronica (CMML) e nelle cellule di melanoma resistenti ai farmaci. Non è noto quale dei composti presenti nella frazione attiva di B. albiflora possa causare l’attivazione della via estrinseca dell’apoptosi. In ogni caso, ci sono rapporti sull’induzione dell’apoptosi tramite l’attivazione della segnalazione estrinseca mediata da triterpenoidi naturali e sintetici. Inoltre, il triterpenoide di tipo lanostano, l’acido poliporenico C isolato da Poriacocos, induce l’apoptosi mediata dalla caspasi-8 nel cancro del polmone umano. In particolare, è stato dimostrato che il β-sitosterolo (isomero strutturale dello stigmasterolo) induce l’apoptosi attraverso l’attivazione della via estrinseca, attivando la segnalazione Fas nelle cellule umane di cancro al seno. Questo potrebbe suggerire che entrambi i componenti triterpenici e sterolici dell’estratto utilizzato in questo studio avrebbero un ruolo importante nell’induzione dell’apoptosi mediata dall’attivazione della via estrinseca.

Figura 3

Il trattamento per sei ore con la frazione esanica di Bonellia macrocarpa ha indotto l’attivazione della caspasi 8. I trattamenti sono stati i seguenti: DMSO (0,05%), controllo (nessun trattamento), etoposide (50 μg/mL), e HFBa (50 μg/mL). Ogni simbolo è la media ± SD relativa attivazione della caspasi da tre saggi, normalizzata con il gruppo di controllo. One-way ANOVA: , ; Tukey’s post-hoc test: contro DMSO e gruppo di controllo; contro DMSO e gruppo di controllo; contro HFBa.

Figura 4

Trattamento durante 12 ore con Bonellia macrocarpa frazione esanica non ha indotto caspasi 9 attivazione. I trattamenti sono stati i seguenti: DMSO (0,05%), controllo (nessun trattamento), etoposide (50 μg/mL), e HFBa (50 μg/mL). Ogni simbolo è la media ± SD relativa attivazione della caspasi da tre saggi, normalizzata con il gruppo di controllo. One-way ANOVA: , ; Tukey’s post-hoc test: rispetto a tutti i gruppi.

Figura 5

Trattamento durante 12 ore con Bonellia macrocarpa frazione esanica indotto caspasi 3 attivazione. I trattamenti sono stati i seguenti: DMSO (0,05%), controllo (nessun trattamento), etoposide (50 μg/mL), e HFBa (50 μg/mL). Ogni simbolo è la media ± SD relativa attivazione della caspasi da tre saggi, normalizzata con il gruppo di controllo. ANOVA a una via: , ; test post-hoc di Tukey: contro DMSO e gruppo di controllo; contro DMSO e gruppo di controllo.

A nostra conoscenza, questa è la prima volta che è stato dimostrato che l’estratto di una pianta utilizzata nella medicina tradizionale Maya possiede un effetto sull’apoptosi. Gli studi futuri saranno diretti alla standardizzazione dell’estratto e alla valutazione di quest’ultimo con modelli in vivo. Ulteriori studi sono necessari per chiarire i composti responsabili dell’attività citotossica osservata e il loro esatto meccanismo di apoptosi.

4. Conclusioni

La frazione esanica delle radici di B. albiflora esercita effetti citotossici e induce apoptosi attraverso la via estrinseca, il che suggerisce il suo potenziale per il trattamento del cancro. Suggeriamo l’isolamento completo dei componenti presenti nella frazione esanica di B. albiflora per la valutazione nel saggio citotossico e l’induzione dell’apoptosi, per chiarire quali sono i composti attivi e per capire il meccanismo d’azione.

Conflitto di interessi

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi e nessuna connessione finanziaria con qualsiasi entità commerciale menzionata nell’articolo.

Riconoscimenti

Questo articolo è stato sostenuto da SEP-CONACYTCB-2010-156755. Gli autori desiderano ringraziare L. Torres-Tapia del Dipartimento di Biotecnologia del Centro di Ricerca Scientifica dello Yucatan (CICY) per l’assistenza tecnica durante l’analisi GC-MS. Gli autori sono, inoltre, grati al Dr. Glenn Jackson per la revisione in lingua inglese dell’articolo.