L’interazione dei raggi X con gli elettroni in un cristallo dà luogo a un modello di diffrazione, che matematicamente è la trasformata di Fourier della distribuzione della densità elettronica. I rivelatori usati per misurare i raggi X, tuttavia, possono misurare solo l’ampiezza dei raggi X diffratti; gli spostamenti di fase, che sono necessari per usare la trasformata di Fourier e trovare la distribuzione della densità degli elettroni, non sono misurabili direttamente con questo metodo. Questo è noto nella comunità fisica come il “problema della fase”. In termini più semplici, le fasi non possono essere trovate dalle ampiezze misurate dei raggi X. Si devono fare altre estrapolazioni e ulteriori esperimenti per ottenere una mappa della densità degli elettroni. Molte volte, i dati esistenti sulle proprietà fisiche e chimiche del composto possono aiutare quando la mappa di densità è scarsa. Un altro metodo conosciuto come Sintesi di Patterson è molto utile per trovare una stima iniziale delle fasi ed è molto utile per le fasi iniziali per determinare la struttura delle proteine quando le fasi non sono note. Il problema può essere semplificato trovando un atomo, di solito un metallo pesante, usando la Sintesi di Patterson e poi usando la posizione di quell’atomo per stimare le fasi iniziali e calcolare una mappa iniziale di densità elettronica che può aiutare ulteriormente nella modellazione della posizione di altri atomi e migliorare ancora di più la stima delle fasi. Un altro metodo è chiamato sostituzione molecolare; esso individua la posizione della struttura della proteina nella cellula. Oltre al metodo di sostituzione molecolare, il problema della fase può anche essere risolto con il metodo di sostituzione isomorfa, il metodo della diffrazione anomala a lunghezza d’onda multipla, il metodo della diffrazione anomala a lunghezza d’onda singola e i metodi diretti.

Molecular ReplacementEdit

Il problema della fase può essere risolto avendo un modello atomico che può calcolare le fasi. Un modello può essere ottenuto se la struttura della proteina correlata è nota. Tuttavia, per costruire questo modello atomico, è necessario determinare l’orientamento e la posizione del modello nella nuova cella unitaria. È qui che entra in gioco la tecnica della sostituzione molecolare (o MR).

La sostituzione molecolare, conosciuta anche come MR, è un metodo per risolvere i problemi di fase nella cristallografia a raggi X. MR individua l’orientamento e la posizione di una struttura proteica con la sua cella unitaria, la cui struttura proteica è omologa alla struttura proteica sconosciuta che deve essere determinata. Le fasi ottenute possono aiutare a generare mappe di densità elettronica e a produrre intensità calcolate della posizione del modello della struttura proteica alle strutture osservate dall’esperimento di cristallografia a raggi x.

Il metodo MR è anche efficace per risolvere strutture cristalline macromolecolari. Questo metodo richiede meno tempo e sforzo per la determinazione strutturale, poiché non è necessario preparare i derivati degli atomi pesanti e raccogliere i dati. Il metodo è diretto e la costruzione del modello è semplificata perché non ha bisogno di tracciare la catena.

Questo metodo consiste di due passi:

1. una ricerca rotazionale per orientare il modello omologo nella cella unitaria o target
2. un target traslazionale dove il nuovo modello orientato è posizionato nella cella unitaria

Patterson-based (Molecular Replacement)Edit

Le mappe di Patterson sono mappe vettoriali interatomiche che contengono picchi per ogni atomo relativo nella cella unitaria. Se le mappe di Patterson sono state generate sulla base dei dati derivati dalle mappe di densità elettronica, le due mappe di Patterson dovrebbero essere strettamente correlate tra loro solo se il modello è correttamente orientato e collocato nella posizione corretta. Questo ci permetterà di dedurre informazioni sulla posizione della struttura proteica sconosciuta con la sua cella. Tuttavia, c’è un problema con la sostituzione molecolare, ha sei dimensioni, tre parametri per specificare orientamento e posizione. Con le mappe di Patterson, può essere divisa in sottoinsiemi di parametri per guardare ogni parte separatamente.

Funzione di rotazioneModifica

La funzione di rotazione ha vettori intramolecolari che dipendono solo dall’orientamento della molecola e non dalla sua posizione perché anche quando la molecola è traslata nella cella unitaria, tutti gli atomi sono spostati della stessa quantità ma i vettori tra gli atomi sono gli stessi. La mappa di Patterson per la struttura della proteina sconosciuta è confrontata con la struttura omologa della proteina nota in diversi orientamenti

Funzione Classica di RotazioneModifica

Per trovare l’orientamento, determina l’asse di rotazione e l’angolo di rotazione intorno a quell’asse. Due parametri saranno necessari per definire un asse (un vettore dal centro della sfera ad un punto sulla superficie della sfera). L’asse di rotazione inizia parallelamente all’asse z e viene ruotato attorno all’asse y con angolo ᶱ, poi l’oggetto ruota attorno all’asse z con angolo ᶲ, e infine ruota attorno all’asse di rotazione con angolo ᵠ. Questi specificano un punto sulla superficie di una sfera unitaria.

Fast Rotation FunctionEdit

La funzione di rotazione può essere calcolata confrontando due mappe di Patterson o i picchi in quelle Patterson. La funzione di rotazione può essere calcolata molto più velocemente con le trasformate di Fourier solo se i Patterson sono espressi in termini di armoniche sferiche.

Funzione di rotazione direttaModifica

Nella funzione di rotazione diretta, la struttura della proteina può essere posta nella cella unitaria della struttura sconosciuta e il Patterson per la molecola orientata viene confrontato con l’intero Patterson della struttura sconosciuta.

Funzione di traduzioneModifica

Una volta che l’orientamento della struttura nota è noto il suo modello (mappa di densità elettronica) può essere orientato per calcolare i fattori di struttura dove una funzione di correlazione viene utilizzata per determinare il vettore per tradurre il modello sopra quello omologo all’interno di un’unità asimmetrica.

Con i modelli di fase orientati e tradotti corretti della struttura proteica, è abbastanza preciso per derivare le mappe di densità elettronica dalle fasi derivate. Le mappe di densità elettronica possono essere usate per costruire e raffinare il modello della struttura sconosciuta.

Diffrazione anomala a più lunghezze d’ondaModifica

I raggi X sono generati in grandi macchine chiamate sincrotroni. I sincrotroni accelerano gli elettroni fino a quasi la velocità della luce e li fanno viaggiare attraverso un grande anello poligonale di metallo cavo. Ad ogni angolo, i magneti piegano il flusso di elettroni, causando l’emissione di energia sotto forma di radiazione elettromagnetica. Poiché gli elettroni si muovono alla velocità della luce, emettono raggi X ad alta energia.

I vantaggi dell’uso dei sincrotroni è che i ricercatori non devono far crescere più versioni di ogni molecola cristallizzata, ma solo un tipo di cristallo che contiene selenio. Hanno quindi la possibilità di sintonizzare la lunghezza d’onda per abbinare le proprietà chimiche del selenio. Questa tecnica è conosciuta come Diffrazione Anomala a Lunghezza d’Onda Multipla. I cristalli vengono poi bombardati più volte con lunghezze d’onda di diversa lunghezza, e alla fine emerge un modello di diffrazione che permette ai ricercatori di determinare la posizione degli atomi di selenio. Questa posizione può essere usata come riferimento o marcatore per determinare il resto della struttura. I vantaggi di questo permettono ai ricercatori di raccogliere i loro dati molto più rapidamente.

Metodo di sostituzione isomorfaModifica

Questo metodo confronta i modelli di diffrazione dei raggi X tra il cristallo originale della proteina e lo stesso tipo di cristallo con un’aggiunta di almeno un atomo con un alto numero atomico. Il metodo è stato usato per determinare la struttura di piccole molecole e infine quella dell’emoglobina da Max Ferdinand Perutz (1914-2002). Un isomorfismo perfetto è quando il cristallo originale e il suo derivato hanno esattamente la stessa conformazione della proteina, la posizione e l’orientamento delle molecole e i parametri della cella unitaria. L’unica differenza che il cristallo e il suo derivato hanno in un isomorfismo perfetto sono le differenze di intensità dovute all’aggiunta di atomi pesanti sul derivato. Queste differenze possono essere identificate manualmente o da una procedura di ricerca automatica di Patterson, come SIR 2002, SHELXD, nB e ACORN, e tali informazioni sono importanti per determinare gli angoli di fase della proteina. Tuttavia, l’isomorfismo perfetto difficilmente si verifica a causa del cambiamento delle dimensioni delle cellule. Per la proteina con atomo pesante, il suo cambiamento tollerabile nella dimensione della cella è dmin/4, poiché dmin è il limite di risoluzione. Anche altri fattori, come la rotazione, contribuiscono al non isomorfismo.

ProcedureModifica

1. Preparate alcuni derivati della proteina in struttura cristallina. Poi, misurate la dimensione della cella per controllare l’isomorfismo.
2. Raccogliete i dati di intensità dei raggi X della proteina originale e del suo derivato.
3. Applicate la funzione Patterson per determinare le coordinate dell’atomo pesante.
4. Raffinate i parametri dell’atomo pesante e calcolate l’angolo di fase della proteina.
5. Calcolate la densità elettronica della proteina.

I derivati sono fatti con due metodi diversi. Il metodo preferito è quello di immergere il cristallo della proteina in una soluzione composta in modo identico alla soluzione madre, ma con un leggero aumento della concentrazione del precipitante. Un altro metodo è la co-cristallizzazione, ma non è comunemente usato perché il cristallo non crescerà o crescerà nonisomorfo. La procedura di ammollo dipende da quanto sono larghi i pori del cristallo. I pori dovrebbero essere abbastanza larghi da permettere al reagente di diffondersi nel cristallo e di raggiungere i siti reattivi sulla superficie di tutte le molecole proteiche nel cristallo.

Metodo della Diffrazione Anomala a Lunghezza d’Onda MultiplaModifica

La Diffrazione Anomala a Lunghezza d’Onda Multipla (abbreviato MAD) è un metodo utilizzato nella cristallografia a raggi X che ci permette di determinare le strutture delle macromolecole biologiche, come proteine e DNA, per risolvere il problema di fase. I requisiti per la struttura includono atomi che causano una significativa dispersione dei raggi X; in particolare zolfo o ioni metallici delle metalloproteine. Poiché il selenio può sostituire lo zolfo naturale, è più comunemente usato. L’uso di questa tecnica facilita notevolmente il cristallografo dall’uso del metodo di sostituzione isomorfa multipla (MIR), poiché la preparazione di composti pesanti è superflua.

Questo metodo è usato per risolvere problemi di fase, quando non ci sono dati disponibili riguardo alla diffrazione diffusa oltre alle ampiezze. Inoltre, viene utilizzato quando un atomo di metallo pesante è già legato all’interno della proteina o quando i cristalli della proteina non sono isomorfi, il che è inadatto al metodo MIR. Il metodo è stato utilizzato principalmente per la soluzione di metallo pesante, questo enzima metallico viene normalmente dalla 1a serie di transizione e i loro vicini. è importante avere una fonte per un potente campo magnetico per effettuare questo esperimento, ambiente come la metropolitana dovrebbe essere considerato. Un acceleratore di particelle chiamato sincrotrone è anche richiesto per il metodo.

Metodo di diffrazione anomala a lunghezza d’onda singolaModifica

In confronto alla diffrazione anomala a più lunghezze d’onda (MAD), diffrazione anomala a lunghezza d’onda singola (SAD) utilizza un singolo set di dati da una singola lunghezza d’onda. La principale differenza positiva tra MAD e SAD è che il cristallo trascorre meno tempo nel fascio di raggi X con SAD, il che riduce i potenziali danni da radiazioni alla molecola. Inoltre, poiché il SAD utilizza solo una lunghezza d’onda, è più efficiente in termini di tempo rispetto al MAD.

Le mappe di densità elettronica derivate dai dati di diffrazione anomala a lunghezza d’onda singola hanno bisogno di subire modifiche per risolvere le ambiguità di fase. Una tecnica di modifica comune è l’appiattimento del solvente, e quando il SAD è combinato con l’appiattimento del solvente, le mappe di densità degli elettroni che ne risultano sono di qualità paragonabile a quelle che derivano dalla fasatura MAD completa. L’appiattimento del solvente comporta la regolazione della densità elettronica delle regioni interstiziali tra le molecole della proteina occupate dal solvente. Si suppone che la regione del solvente sia relativamente disordinata e priva di caratteristiche rispetto alla proteina. Lisciando la densità di elettroni nelle regioni del solvente, la densità di elettroni della proteina sarà migliorata in misura interpretabile. Questo metodo è chiamato ISAS, scattering anomalo iterativo a lunghezza d’onda singola.

Metodi direttiModifica

Il metodo diretto può aiutare a recuperare le fasi usando i dati che ottiene. Il metodo diretto stima le fasi iniziali e in espansione usando una tripla relazione. La relazione tripla (trio) è la relazione dell’intensità e della fase di una riflessione con altre due intensità e fasi. Quando si usa questo metodo, la dimensione della struttura proteica è importante poiché la distribuzione di probabilità della fase è inversamente proporzionale alla radice quadrata del numero di atomi. Il metodo diretto è la tecnica più utile per risolvere i problemi di fase.