STRUCTURAL BASES FOR MECHANISM OF ACTION

Il 16S rRNA di Escherichia coli è ben studiato tra le subunità di rRNA, e in particolare, sono state esaminate le interazioni di vari antibiotici aminoglicosidi con il 16S rRNA e i loro effetti sul processo di traduzione dell’mRNA in polipeptide (35). Strutture di rRNA simili esistono in altri organismi, come il lievito e Tetrahymena (33). Il trattamento dell’rRNA con un aminoglicoside protegge diverse basi nucleiche nell’rRNA dalle modificazioni chimiche, il che implica che queste molecole possiedono un’alta affinità per certi siti nell’rRNA. Questa modalità di legame è stata paragonata da Noller (35) a quella degli inibitori enzimatici, che di solito si legano ai siti attivi degli enzimi e interferiscono con le loro attività. Diverse classi di antibiotici aminoglicosidi si legano a diversi siti sull’rRNA, a seconda della complementarità strutturale tra i due. Per esempio, si ritiene che la neomicina, la paromomicina (Fig. 1), la gentamicina e la kanamicina si leghino al sito A dell’rRNA 16S in E. coli in modo simile e hanno dimostrato di proteggere le basi A1408 e G1494 in esperimenti di impronta chimica (Fig. 2) (33). Quattro basi, A1408, A1492, A1493 e G1494, nel sito A dell’rRNA interagiscono con il tRNA, anche se con diverse affinità. Il legame dei suddetti aminoglicosidi al sito A nella regione di decodifica (cioè il sito di riconoscimento dei codoni e degli anticodoni) interferisce con il riconoscimento accurato del tRNA cognato da parte dell’rRNA durante la traduzione (35). Si pensa che queste interazioni interferiscano anche con la traslocazione del tRNA dal sito A al sito del peptidil-tRNA (sito P).

Puglisi e colleghi (12-14, 39) hanno recentemente fornito prove strutturali sul modo di interazione della paromomicina, un aminoglicoside rappresentativo della classe della neomicina, con un template di RNA di 27 nucleotidi che è stato progettato per imitare la regione A-site del 16S rRNA in E. coli (Fig.3A). La progettazione del modello di RNA era basata sulla conoscenza precedente che la paromomicina interagisce con la coppia di basi C1407 – G1494, A1408, A1493, e U1495 e che queste basi sono assolutamente necessarie per il legame ad alta affinità (39) (mostrato in grigio in Fig. 3A). Altre caratteristiche strutturali, come la tasca creata dall’asimmetria nella regione del loop interno dovuta alla presenza di A1492 e l’accoppiamento di basi C1409 – G1491 nella regione del gambo inferiore, sono anche importanti. Queste caratteristiche strutturali creano collettivamente una tasca ottimale per il legame della paromomicina (vedi sotto).

Nel modello di RNA nativo del sito A, il gambo ha interazioni di base-accoppiamento a U1406 – U1495 (non canoniche) e C1407 – G1494 (Fig 3A). Dopo il legame della paromomicina, la struttura distinta formata da A1408, A1492 e A1493 è stabilizzata (Fig. 2B) e le basi A1408 e A1493 formano una coppia di basi non canoniche (12, 39). Il nucleotide A1492, che non ha interazioni di base-accoppiamento, crea una piega nella struttura dell’RNA, e gli effetti combinati di A1492 e della coppia di basi A1408 – A1493 creano un rigonfiamento nel sito A dove la paromomicina si lega ed estende ulteriormente l’angolo della piega (Fig. 2B). I gruppi funzionali sulla paromomicina, come i gruppi idrossile e amminico, partecipano a specifiche interazioni con la molecola di RNA (vedi sotto).

La tasca creata da A1492 e dalla coppia di basi A1408 – A1493 è occupata dall’anello II della paromomicina, e questo anello si impila sopra la base G1491 (mostrato da una freccia gialla nella Fig. 2B) (12). L’anello I della paromomicina fa contatti specifici con le coppie di basi “universalmente” conservate U1406 – U1495 e C1407 – G1494 nell’rRNA. È da notare che l’anello I è assolutamente necessario per il legame specifico degli antibiotici aminoglicosidi all’rRNA. Gli anelli III e IV della paromomicina estendono ulteriormente queste interazioni nel solco maggiore dell’rRNA. Le società amminica e idrossilica contribuiscono principalmente alle interazioni non specifiche della paromomicina con l’rRNA; quindi, non sono interazioni dipendenti dalla sequenza. Un altro punto importante è che la coppia di basi C1409 – G1491 fornisce la sede per il legame dell’aminoglicoside nella tasca, e una coppia di basi mismatch in questa posizione risulta nella perdita del legame (12). In generale, gli aminoglicosidi che condividono caratteristiche strutturali con la paromomicina si legano all’rRNA in modo simile (13). Tuttavia, diversi antibiotici aminoglicosidi sembrano legarsi allo stesso sito di legame in più di una conformazione (28). In sostanza, la conformazione dell’aminoglicoside che si lega all’RNA deve soddisfare i vincoli elettronici e sterici del sito di legame. In un altro studio sul complesso della gentamicina Cla e il modello di RNA del sito A, gli anelli I e II della gentamicina Cla (che sono simili a quelli della paromomicina) hanno mostrato interazioni di legame simili a quelle del complesso della paromomicina e del modello di RNA del sito A (57). Tuttavia, l’anello III nella gentamicina Cla interagisce con le coppie di basi U1406 – U1495 e G1405 – C1496 nella regione superiore del gambo (Fig. 3A). Da queste osservazioni, Puglisi e collaboratori (57) hanno proposto che tutti gli aminoglicosidi che hanno come bersaglio il sito A dell’rRNA 16S si legano in un modo comune, simile agli anelli I e II in paromomicina e gentamicina.

Anche se la struttura generale dell’rRNA è conservata tra tutte le specie in senso evolutivo, ci sono differenze che rendono il legame degli aminoglicosidi più specifico, con un’affinità almeno 10 volte maggiore, all’rRNA dei procarioti che a quello degli eucarioti (19, 35, 38). Questa non è una grande differenza di affinità di legame e può in parte spiegare gli effetti tossici di questi antibiotici nei sistemi dei mammiferi. L’rRNA eucariotico contiene una guanina al posto di A1408, con conseguente coppia di basi G1408 – A1493. Inoltre, la coppia di basi abbinata a C1409 – G1491 non esiste negli eucarioti. Queste differenze risultano collettivamente in una minore affinità degli aminoglicosidi per l’rRNA eucariotico (12, 19, 35, 38). Avendo delineato queste differenze, il legame degli aminoglicosidi al sito A dell’rRNA nei procarioti altera la conformazione del sito A e influenza le interazioni specifiche dell’mRNA e del tRNA in questo sito, dando luogo a interazioni codone-anticodone irregolari. C’è una scarsità di informazioni strutturali sulle specifiche di queste interazioni a livello ribosomiale fino ad oggi (vedi sotto), ma la chiara e ultima conseguenza è l’interruzione del processo di traduzione.

Un altro studio strutturale è stato eseguito sul legame della tobramicina (Fig.1) ad un aptamero RNA (23). L’RNA aptamer utilizzato in questo studio era un RNA stem-loop di 26 nucleotidi (Fig. 3B). Ci sono quattro coppie di mismatch, U7 – G20, G8 – U19, G9 – A18, e U11 – U16, in questo aptamero di RNA che fanno parte dell’anello a spirale. La tobramicina si lega in questo solco parzialmente incapsulato dalla superficie del solco profondo e dalla base di guanina del residuo G15 (Fig. 4). In questo complesso, l’anello I della tobramicina si trova sul pavimento del solco profondo. Uno dei gruppi amminici sull’anello II della tobramicina interagisce con la spina dorsale del fosfato nel solco profondo, e l’altro gruppo amminico è esposto al solvente. L’anello III è posizionato al centro del solco profondo, con gruppi idrossilici diretti verso il pavimento del solco. La conformazione dell’aptamero RNA sopra descritta è stata suggerita essere simile a quella degli anelli a forcina nel tRNA e nell’rRNA (23).

La struttura a raggi X a 7,5-Å di risoluzione del complesso funzionale dell’rRNA 70S di T. thermophilus contenente tRNA e mRNA è utile per mettere in prospettiva la discussione precedente (5). Da questa struttura, si potrebbe immaginare quanto bene gli studi modello con modelli di RNA più piccoli come l’aptamer tobramicina-RNA e l’A-site-RNA con paromomicina (vedi sopra) si adatterebbero alla struttura completa dell’rRNA. Il sito A nella subunità 16S dell’rRNA 70S è visto vicino all’interfaccia del tRNA e della subunità 50S dell’rRNA, in prossimità della coppia codone-anticodone (Fig. 2A). Confrontando la struttura della soluzione del modello di RNA del sito A con il sito A nella struttura a raggi X dell’rRNA 70S, la struttura a raggi X sembra essere strettamente legata al modello di RNA legato alla paromomicina, ma non alla struttura nativa della soluzione del modello di RNA del sito A (5). Questo è intrigante e suggerisce che forse nella forma funzionale il rigonfiamento o la piega vicino alle basi A1492 e A1493 esiste sempre nell’rRNA 70S. Se questo fosse vero, implica che la tasca di legame per la paromomicina è già esistente quando l’rRNA 70S diventa funzionale; quindi, è predisposto per l’inibizione della paromomicina. Questo contraddice l’affermazione che il legame della paromomicina aumenta l’angolo di curvatura nel sito di legame. Prove a sostegno di questa idea vengono da uno studio recente che ha suggerito che le affinità dei diversi aminoglicosidi per il template RNA del sito A sono diverse, e anche la capacità di questi antibiotici di inibire la sintesi proteica in vitro varia (15). La gentamicina e diversi altri antibiotici correlati interagiscono con l’A-site RNA con costanti di dissociazione (Kd) nell’intervallo micromolare, ma inibiscono un processo di traduzione in vitro, con concentrazioni inibitorie del 50% nell’intervallo nanomolare (15). Quest’ultima scoperta è stata dedotta come il risultato del legame dell’aminoglicoside all’rRNA intatto nella regione di decodifica (A-site), e la differenza nel legame all’rRNA intatto rispetto a quello all’RNA modello A-site può essere dovuta alle differenze nelle conformazioni di questi due RNA, come discusso sopra.

L’A-site ha deboli contatti con l’mRNA e il tRNA, implicando che questa regione gioca un ruolo nel riconoscimento del tRNA appropriato attraverso sottili cambiamenti nell’energia libera (5). Il legame dell’aminoglicoside vicino a questo sito può influenzare il delicato processo di interazioni tra codone e anticodone. È stato anche proposto che la presenza di un aminoglicoside stabilizzi il complesso di mRNA e tRNA al sito A, che a sua volta influenza il processo di traduzione (5). È difficile ipotizzare tutti gli effetti degli aminoglicosidi sulla struttura dell’rRNA, e ulteriori studi strutturali con gli aminoglicosidi legati ai complessi, come l’rRNA 70S, saranno utili per chiarire e comprendere i sottili cambiamenti che portano alle azioni antibiotiche degli aminoglicosidi.

Alcune indagini hanno utilizzato sonde sintetiche per comprendere le interazioni tra i modelli di RNA e gli aminoglicosidi. È stato suggerito che gli aminoglicosidi si legano a più di un sito bersaglio nel ribozima (6, 30). Recentemente, diversi antibiotici aminoglicosidi come la neomicina B, la tobramicina e la kanamicina A sono stati dimerizzati simmetricamente o asimmetricamente usando un “tether”, e le loro affinità di legame sono state confrontate con quelle degli aminoglicosidi monomerici genitori (30). È stato suggerito che se ci fossero più siti di legame sull’RNA, gli aminoglicosidi dimerizzati dovrebbero legarsi con una maggiore affinità rispetto all’antibiotico genitore, a condizione che più siti di legame siano accessibili. È stato infatti osservato che gli aminoglicosidi dimerizzati si legano al ribozima Tetrahymena da 20 a 1.200 volte meglio degli aminoglicosidi genitori. Una spiegazione per la maggiore affinità di legame potrebbe essere il maggior numero di gruppi amminici caricati positivamente sull’aminoglicoside dimerizzato, ma questo effetto sembra essere sinergico con il vantaggio entropico ottenuto dalla dimerizzazione (30). Ha anche indicato la presenza di più siti di legame ad alta affinità per gli antibiotici aminoglicosidi in una molecola di RNA. Un altro studio ha tentato di sfruttare le proprietà di legame all’RNA della paromomicina e i comportamenti intercalanti di alcuni composti come il pirene e il tiazolo arancio (48). Questa strategia prevedeva gli aminoglicosidi come mezzo per la consegna di agenti intercalanti all’RNA. Il coniugato di paromomicina con tiazolo arancio o pirene ha mostrato migliori proprietà di legame al template di RNA a 27 nucleotidi A-site. Infatti, la costante di dissociazione per il coniugato paromomicina-arancio tiazolo è stata misurata a 46 nM, che è stata riportata come la più alta affinità che l’rRNA A-site ha mostrato per qualsiasi ligando.

I requisiti strutturali per il legame dell’RNA da parte degli aminoglicosidi hanno indicato che una protuberanza nella sequenza dell’RNA è necessaria per permettere il legame degli aminoglicosidi (7). Utilizzando un derivato specifico dell’aptamero dell’RNA, è stata eseguita una serie di studi di interferenza chimica, modifica chimica e mutazione per comprendere i requisiti strutturali per il legame della tobramicina all’aptamero dell’RNA. Questo aminoglicoside sembra interagire principalmente con le basi nucleiche nell’RNA aptamer ma non con il backbone fosfato. La presenza di un rigonfiamento, tuttavia, è stata proposta come importante per il legame ad alta affinità della tobramicina in un rapporto stechiometrico, ed è stato concluso che un rigonfiamento crea una cavità per le interazioni dell’aminoglicoside e della base nucleica (7). Questa analogia può essere applicata ad altri siti dell’RNA come la regione dell’hammerhead e il sito A, dove una cavità è presente a causa dell’accoppiamento non canonico delle basi o di loop o rigonfiamenti che creano un sito adatto all’interazione degli aminoglicosidi con i gruppi fosfato anionici e le basi nucleiche. Su questa linea, Westhoff e colleghi (49) hanno avanzato la proposta che l’interazione degli aminoglicosidi con l’RNA sia probabilmente specifica per la forma piuttosto che per la sequenza.

Coerentemente con questo concetto, i campi elettrostatici nelle pieghe dell’RNA sono stati considerati la forza guida per il legame (vedi sotto). Hermann e Westhoff (20) sono stati in grado di identificare le conferme di docking di diversi antibiotici aminoglicosidi in vari modelli di RNA, come gli aptamers tobramicina-RNA e la regione A-site nell’RNA 16S, per i quali erano disponibili informazioni strutturali. Sulla base di queste osservazioni, è stata prevista la modalità di legame degli aminoglicosidi alla regione dell’elemento di risposta trans-attivante nell’HIV (20). In un altro studio sulla RRE nell’HIV, la regione di legame della proteina Rev, Cho e Rando (8) hanno studiato il ruolo di un rigonfiamento a base singola e di una cavità per il legame degli aminoglicosidi. Coerentemente con le ipotesi precedenti, è stato dedotto che le scanalature nelle regioni non duplex dell’RNA sono importanti per il legame ad alta affinità degli aminoglicosidi all’RNA. In questo caso, il rigonfiamento della singola base non ha influenzato il legame, ma la cavità, una regione ricca di G costituita da due coppie di basi non canoniche e una singola U rigonfia, ha un’alta affinità per gli aminoglicosidi. La manomissione della cavità ha diminuito l’affinità della RRE RNA per gli aminoglicosidi, indicando così che i rigonfiamenti non canonici contenenti coppie di basi sono i siti primari di legame degli aminoglicosidi in questo modello di RNA (8).