Materiale vegetale

Le foglie di Strychnos spinosa Lam. sono state raccolte nel gennaio 2013 dal villaggio di Sakara, Zaria, Nigeria. Il materiale vegetale è stato identificato da Musa Muhammad un botanico della sezione erbario del Dipartimento di Scienze Biologiche (Ahmadu Bello University, Zaria) dove è stato depositato un esemplare voucher (No 900161). Le foglie raccolte sono state essiccate in una stanza ventilata e priva di contaminazioni e poi macinate in polvere con un Macsalab Mill (Model 2000 LAB Eriez), conservate in un contenitore di vetro e tenute al buio a temperatura ambiente (25 ± 3°C) prima dell’uso.

Estrazione e frazionamento liquido-liquido

Estrazioni di acetone, metanolo e diclorometano/metanolo

Una variazione del metodo di Suffness & Douros è stata usata per frazionare i componenti presenti nei diversi estratti di foglie. La polvere di foglie essiccate (2 kg) è stata macerata tre volte in acetone (6 l) per ottenere l’estratto di acetone (AcetE, 75 g) dopo la filtrazione e la rimozione del solvente sotto vuoto. I residui sono stati ulteriormente macerati in metanolo (6 l) seguendo la stessa procedura descritta per l’estrazione dell’acetone per ottenere l’estratto di metanolo (MetE, 119,2 g). Una parte delle foglie essiccate in polvere (1 kg) è stata anche estratta in una miscela (1/1, v/v) di diclorometano/metanolo (3 l) tre volte per dare l’estratto di diclorometano/metanolo (DcmMetE, 114 g) dopo filtrazione e rimozione del solvente sotto vuoto. Una parte dell’estratto di acetone (70 g) è stata sciolta e frazionata in una miscela (1/1, v/v) di cloroformio e acqua per ottenere le frazioni di acqua e cloroformio. Il n-butanolo è stato aggiunto alla frazione di acqua per ottenere le frazioni di n-butanolo (nButF, 25,1 g) e acqua (Wat1, 5 g). La frazione di cloroformio è stata concentrata a secco e sciolta in acqua al 10% in metanolo prima dell’estrazione con esano. La frazione di esano (HexF, 23. 9 g) e il residuo del 10% di acqua in metanolo sono stati quindi ottenuti dopo l’aggiunta di n-esano. La proporzione di acqua in metanolo è stata aumentata per permettere il 35% di acqua in componente metanolica che infine ha dato cloroformio (ChlF, 7,05 g) e il 35% di acqua (wat2, 2,8 g) frazioni dopo l’aggiunta di cloroformio. Dalla TLC comparativa, le frazioni acqua (Wat1) e 35% acqua in metanolo (Wat2) sono state combinate in una frazione (WatF, 7,8 g).

Estrazione di alcaloidi

Le foglie di S. spinosa (1 kg) sono state macerate con la miscela (96:3:1, v/v) di EtOAc-EtOH-NH4OH (600 ml) e poi percolate con EtOAc per dare l’estratto (26 g) dopo la rimozione del solvente usando l’evaporatore rotante sotto pressione ridotta. L’estratto è stato sciolto in EtOAc ed estratto con acido acetico al 4% per ottenere la frazione EtOAc (EtAcF, 20,02 g). La soluzione acida (pH 3-4) è stata basificata a pH (8-9) con Na2CO3 ed estratta tre volte con DCM per dare estratto grezzo di alcaloidi (AlkE, 2,8 g) dopo la rimozione del solvente sotto vuoto.

Saggio antimicrobico

Microorganismi e preparazione dell’inoculo

I microorganismi usati erano tre batteri Gram-positivi, Bacillius cereus (ATCC 14579), Staphylococcus aureus (ATCC 29213) e Enterococcus faecalis (ATCC 29212), un batterio Gram-negativo, Escherichia coli (ATCC 25922); e quattro funghi tra cui tre lieviti Candida albicans, Cryptococcus neoformans (isolati animali) e Candida albicans (ATCC 10231) e un fungo filamentoso Aspergillus fumigatus. Alcuni ceppi fungini utilizzati sono stati coltivati da casi clinici di malattie infettive fungine negli animali, prima del trattamento, nel Dipartimento di Malattie Tropicali Veterinarie, Facoltà di Scienze Veterinarie. C. albicans è stato isolato da un fringuello di Gouldian, C. neoformans da un ghepardo, mentre A. fumigatus è stato isolato da un pollo che soffriva di una micosi sistemica.

Le colture batteriche e fungine sono state prelevate da piastre di agar fresco 24 ore e inoculate in brodo di destrosio Sabouraud (SDB) fresco per i funghi e brodo Mueller-Hinton (MHB) (Fluka, Svizzera) per i batteri, prima di condurre il test. La torbidità della sospensione microbica è stata regolata a un McFarland standard 0,5 equivalente a concentrazioni di 1-5 × 108 e 1-5 × 107 ufc/ml per i batteri e i funghi, rispettivamente. Le sospensioni microbiche sono state ulteriormente diluite (1:100) in media per ottenere un inoculo finale di circa 1,5 × 106 cfu/ml per i batteri e 1,5 × 105 cfu/ml per i funghi.

Determinazione della concentrazione minima inibitoria

Per determinare i valori della concentrazione minima inibitoria (MIC) degli estratti e delle frazioni contro i batteri e i funghi è stato utilizzato un metodo di microdiluizione seriale duplice con violetto di tetrazolio come indicatore della crescita microbica, come modificato da Masoko et al. .

A 100 μl (10 mg/ml) di estratti e frazioni disciolti in dimetilsulfossido (DMSO) sono stati diluiti serialmente due volte con acqua distillata sterile in piastre da 96 pozzetti per microtitolazione e ad ogni pozzetto sono stati aggiunti 100 μl di coltura microbica appena preparata in MHB o SDB. Il DMSO (5%) è stato usato come controllo negativo mentre la gentamicina (1 mg/ml) e l’amfotericina B erano controlli positivi. Le piastre da microtitolazione sono state sigillate in sacchetti di plastica e incubate per 24 ore a 37°C. Successivamente, 40 μl di 0,2 mg/ml di p-iodonitrotetrazolio violetto (INT) sono stati aggiunti ad ogni pozzetto e le piastre da microtitolazione sono state ulteriormente incubate a 37°C. Le concentrazioni minime inibitorie sono state determinate dopo 1 e 2 ore per i batteri, e 16 e 36 ore per i funghi. La MIC è stata determinata come la concentrazione più bassa che inibisce la crescita microbica, indicata da una diminuzione dell’intensità del colore rosso della formazan.

Saggi antiossidanti

Le attività antiossidanti degli estratti e delle frazioni delle foglie di S. spinosa sono state determinate in termini di capacità di scavenging dei radicali liberi utilizzando il 2,2′-difenil-1-picryhydrazyl (DPPH) e il 2,2-azino-bis (acido 3-etilbenzotiazoline-6-solfonico) sale di ammonio (ABTS).

Saggio DPPH

L’attività antiossidante è stata eseguita come descritto da Du Toit et al. con leggere modifiche. I campioni sono stati sciolti in metanolo di grado HPLC (Sigma-Aldrich, Germania) e diluiti due volte in serie a intervalli di concentrazione da 1000 a 7,81 μg/ml per estratti e frazioni, e da 40 a 0,31 μg/ml per un riferimento standard di acido L-ascorbico (Sigma, Germania). In breve, 40 μl di campioni (10 mg/ml) sono stati introdotti in piastre da microtitolazione a 96 pozzetti (Bioster, Spagna) e diluiti due volte in serie in metanolo. Successivamente, 160 μl di (3,7 mg/100 ml) soluzione metanolica di 2,2-difenil-1-picryhydrazyl (DPPH) sono stati introdotti in ogni pozzetto e dopo 30 minuti di incubazione a temperatura ambiente al buio e l’assorbanza è stata misurata a 517 nm utilizzando un lettore di micropiastre multimodale (BioTek, USA). L’attività free-radical-scavenging di ogni campione e lo standard di riferimento sono stati determinati come percentuale dell’inibizione ottenuta dalla seguente formula:

Con Absample come l’assorbanza dell’estratto con DPPH, Abblank come l’assorbanza dell’estratto senza DPPH e Abcontrol come assorbanza di metanolo e DPPH. La concentrazione dei campioni che riducono il 50% dei radicali liberi DPPH (IC50) è stata determinata tracciando la percentuale di inibizione contro le concentrazioni dei campioni. Il test è stato replicato tre volte e i risultati sono espressi come media ± deviazione standard.

Saggio ABTS

La capacità di ABTS di scavenging del radicale degli estratti e delle frazioni è stata determinata usando un metodo di Re et al. con leggere modifiche. Brevemente, il radicale ABTS è stato generato facendo reagire una soluzione di 7 mM di ABTS e una soluzione di 2,45 mM di persolfato di potassio a temperatura ambiente per 12 ore. L’assorbanza della soluzione stock di radicale ABTS è stata regolata a 7,00 ± 0,02 a 734 nm prima dell’uso. 40 μl di una soluzione di estratti o frazioni dissolti in metanolo di grado HPLC (Sigma-Aldrich, Germania) sono stati introdotti in piastre da microtitolazione e diluiti in serie fino a concentrazioni di 15,62 e 2000 μg/ml. Trolox (Sigma, Germania) e acido L-ascorbico (Sigma, Germania) sono stati preparati in concentrazioni da 200 a 1,56 μg/ml. Successivamente, 160 μl di soluzione ABTS sono stati aggiunti ai pozzetti (tranne il bianco) e l’assorbanza è stata misurata a 734 nm dopo 6 minuti di incubazione a temperatura ambiente. Trolox e acido ascorbico sono stati usati come controlli positivi, metanolo come controllo negativo ed estratti o frazioni senza ABTS come bianco. La percentuale di inibizione dell’ABTS-+ e l’IC50 sono stati calcolati come riportato sopra per il saggio DPPH.

Saggio di citotossicità

La citotossicità degli estratti di acetone e delle frazioni contro le cellule di Vero monkey kidney è stata valutata mediante il saggio di riduzione MTT come precedentemente descritto con leggere modifiche. Le cellule sono state seminate ad una densità di 1 × 105 cellule/ml (100 μl) in piastre da 96 pozzetti e incubate a 37°C e 5% CO2 in un ambiente umidificato. Dopo 24 ore di incubazione, i campioni (100 μl) a varie concentrazioni finali sono stati aggiunti ai pozzetti contenenti le cellule. La doxorubicina è stata usata come riferimento positivo. È stato incluso anche un adeguato controllo in bianco con concentrazioni equivalenti di acetone e le piastre sono state ulteriormente incubate per 48 ore in un incubatore di CO2. Successivamente, il mezzo in ogni pozzetto è stato aspirato dalle cellule, che sono state poi lavate con PBS, e infine il mezzo fresco (200 μl) è stato aggiunto ad ogni pozzetto. Poi, 30 μl di MTT (5 mg/ml in PBS) sono stati aggiunti ad ogni pozzetto e le piastre sono state incubate a 37°C per 4 ore. Il mezzo è stato aspirato dai pozzetti e DMSO è stato aggiunto per solubilizzare i cristalli di formazan formati. L’assorbanza è stata misurata su un lettore di micropiastre BioTek Synergy a 570 nm. L’inibizione della crescita cellulare per ogni estratto è stata espressa in termini di valori LC50, definiti come la concentrazione che ha causato il 50% di inibizione della vitalità cellulare. I valori dell’indice di selettività (SI) sono stati calcolati dividendo i valori di citotossicità LC50 per i valori MIC (SI = LC50/MIC). I test sono stati eseguiti in quadruplicato e ogni esperimento è stato ripetuto tre volte.

Analisi statistica

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in triplicato e i valori espressi come media ± deviazione standard. Le differenze tra i valori sono state valutate per la significatività usando l’analisi della varianza e i risultati sono stati confrontati usando la minima differenza significativa di Fisher (LSD) al livello di significatività del 5%.