Le proteine devono interagire con altre proteine per formare complessi funzionali. In molti casi, la funzione delle proteine all’interno delle cellule non può essere compresa senza informazioni sulla struttura della proteina e senza sapere in quale complesso la proteina è situata.1, 2 Questo è, per esempio, di fondamentale importanza per le proteine che modulano le informazioni epigenetiche sul DNA. Quasi tutte queste proteine che modificano la cromatina richiedono un’intensa interazione con enzimi metabolici, che forniscono i cofattori necessari per l’acetilazione, la deacetilazione o la metilazione e demetilazione degli istoni.3-5 Questo dimostra la necessità di studiare l’ambiente complesso di una data proteina per analizzare la sua funzione e lo stato di attività. Il crosslinking delle proteine, in combinazione con l’analisi mediante spettrometria di massa (XL-MS), è idealmente adatto come metodo per ottenere informazioni sulla struttura delle proteine e la composizione dei complessi proteici.6-9 Per XL-MS, sono necessari reagenti chimici specializzati, reticolanti, che sono in grado di collegare covalentemente i residui di proteine che sono in stretta vicinanza, per esempio, interagendo in un complesso.10, 11 Caratterizzazione dei peptidi crosslinked mediante la spettrometria di massa, tuttavia, pone una sfida formidabile per due motivi. In primo luogo, l’identificazione di crosslink deve essere raggiunto analizzando gli ioni di frammento di non solo uno, ma due, peptidi collegati, complicando così massicciamente MS2 spettri. In secondo luogo, le specie di peptidi reticolati hanno solo un’abbondanza molto bassa e sono parte di una miscela di peptidi che è dominata in modo schiacciante da peptidi non reticolati. In molti casi, questo porta ad una drammatica perdita di informazioni che ostacola l’identificazione accurata di crosslink e quindi l’analisi dell’interactome. Alcuni reagenti crosslinking sono stati sviluppati, che ha introdotto gruppi MS-cleavable, e la possibilità di arricchimento XL per affrontare questi problemi.12-18

In questo caso, riportiamo lo sviluppo di un nuovo reagente crosslinking che è arricchibile e ha proprietà di scissione che consentono l’identificazione accurata crosslink. Il cliXlink progettato (1) è raffigurato nella Figura 1. Il reagente permeabile alle cellule (Figura 1 A e Figura S1 nelle informazioni di supporto) dispone di due unità estere succinimidyl che possono reagire con nucleofili nelle proteine e sono distanziati approssimativamente 9 Å a parte, consentendo così la fissazione di brevi distanze per ottenere informazioni strutturali sulle proteine e per catturare le proteine in prossimità l’uno dell’altro. L’efficiente scissione MS è garantita dal gruppo sulfossido, che può essere scisso in condizioni di dissociazione indotta da collisione a bassa energia (CID) prima della frammentazione del peptide. Inoltre, un’unità alchinica permette un arricchimento moiety, per esempio, biotina, per essere attaccato ai siti reticolati con l’aiuto di reazione CuAAC.19

L’applicazione del reticolatore può seguire il flusso di lavoro raffigurato nella Figura 1 B. Esso comporta l’aggiunta del reagente 1 ad un proteoma complesso, fissando le informazioni di distanza stato nativo di peptidi in stretta vicinanza e preservandoli per tutto il flusso di lavoro ulteriore per l’analisi MS. Fissazione del gruppo di affinità per l’arricchimento viene eseguita dopo reticolazione per evitare interferenze da gruppi di arricchimento ingombranti. Modificando i peptidi reticolati a livello proteico, i reagenti in eccesso delle piccole molecole possono essere facilmente rimossi mediante precipitazione con acetone. Questo è seguito dalla digestione enzimatica delle proteine. I peptidi reticolati sono in questo modo etichettati, per esempio, con la biotina, il che permette il loro arricchimento. In seguito, vengono analizzati per mezzo della spettrometria di massa. Poiché le masse dei singoli peptidi in un crosslink non sono immediatamente accessibili, l’assegnazione del crosslink è difficile, specialmente in campioni complessi. Ciò richiede l’uso di reagenti MS-cleavable, che facilitano l’identificazione MS2 formando ioni frammento specifico.20, 21 Al meglio, il reagente dovrebbe anche consentire esperimenti MS3, che richiede che il crosslinker è scisso prima i peptidi. Questo permette ai peptidi di essere separati per l’identificazione individuale MS3-based. Il nostro reagente 1 contiene β-idrogeno atomi su entrambi i lati del sulfossido, in modo che la frammentazione avviene in due direzioni, come illustrato nella Figura 1 C. Questo porta ad una separazione pulita dei peptidi (α, β) e genera due frammenti per ogni peptide: un alchene e un frammento di acido sulfenico, quest’ultimo forma un thial su perdita di acqua. Questo fornisce due coppie di massa con un caratteristico Δm/z≈32. Soprattutto, abbiamo osservato che la via di frammentazione a (Figura 1 C) ha predominato. Pertanto, per l’α-peptide il frammento alcheno, e per il β-peptide il frammento thial, sono i principali prodotti di scissione. A causa delle proprietà di scissione asimmetrica, la maggior parte dell’intensità del segnale viene mantenuta su un frammento per peptide, che dovrebbe fornire un’eccellente sensibilità negli esperimenti MS3.

La sintesi del reagente 1 è semplice (schema 1). Il punto di partenza è il dimero disolfuro ossidato di omocisteina 2, che viene trattato con acido 4-pentynoic per dare disolfuro 3. La scissione riduttiva del disolfuro e l’alchilazione dei tioli generati con il 3-bromopropionato di metile genera il composto solfuro 4. La saponificazione di entrambi gli esteri metilici a 5 e la conversione di 5 in bissuccinimidil estere attivato 6, seguita dall’ossidazione del tioetere al solfossido, dà il reagente 1 in una resa totale del 16%. È particolarmente importante che il reagente sia molto puro e che le unità reattive dell’estere siano presenti su entrambi i lati. L’idrolisi parziale deve essere evitata. Questo è stato assicurato da una purificazione finale per precipitazione. Il reagente 1 è stato sciolto in una miscela di acetato di etile e diclorometano e precipitato con l’aggiunta di esani.

Abbiamo poi studiato le proprietà MS di 1. A tal fine, abbiamo aggiunto 1 alla proteina modello comunemente usato, sieroalbumina bovina (BSA). Abbiamo seguito il flusso di lavoro raffigurato in Figura 1 B senza eseguire il passo di arricchimento. In breve, dopo l’aggiunta di 1 alla soluzione proteica e la reazione per 1 h a temperatura ambiente e pH fisiologico, abbiamo precipitato la proteina con acetone, risospeso in tampone (vedi le informazioni di supporto) e digerito la proteina successivamente con una miscela di tripsina e Lys-C.

La miscela di peptidi ottenuta è stata dissalata con colonne C18 Tip e analizzata mediante HPLC-MS2 (Figura 2). La Figura 2 A mostra due peptidi BSA reticolati (α+β) come esempio. Dopo aver determinato la massa esatta del crosslink intatto (m / z 677.1; Figura 2 B), abbiamo eseguito sia CID e frammentazione HCD sul precursore per valutare le proprietà di frammentazione (Figura 2 C). La frammentazione CID più selettiva (eccitazione di risonanza dello ione crosslink; Figura 2 C, spettro superiore) ad una bassa energia di collisione normalizzata del 25% fornisce, come previsto, solo una piccola serie di segnali intensi. Due coppie di segnali prominenti, con Δm/z di 32 (Δmrep), sono ottenuti a causa della frammentazione crosslinker, che si traduce in un thial (α-/β-thial) e alkene (α-/β-alkene) frammento per ogni peptide. Come accennato prima, il percorso di frammentazione a (Figura 1 C) è preferito, portando ad una distribuzione di intensità asimmetrica. La formazione dominante del previsto intatto, peptidi separati di conseguenza rende il reagente adatto per esperimenti MS3 più sofisticati.

Per il nostro studio, abbiamo usato la frammentazione HCD. Questo metodo fornisce simultaneamente la scissione del crosslinker e la formazione dei frammenti peptidici necessari per l’identificazione (Figura 2 C, spettro inferiore). Per aiutare con il riconoscimento del crosslink/peptide, è importante che la frammentazione HCD fornisce ancora i frammenti di alchene e thial. I dati HCD, quindi, consentono l’identificazione dei peptidi tramite MS2.

Utilizzando questo metodo, abbiamo analizzato i dati con il software liberamente disponibile MeroX, filtrando rigorosamente tutte le identificazioni crosslink (punteggio >50, false discovery rate (FDR) 1 %) e richiedendo la presenza di almeno tre su quattro ioni dalle due coppie di massa caratteristica.23, 24 Senza sfruttare la possibilità di CuAAC arricchimento basato, siamo stati in grado di identificare 61 crosslink unici BSA in una singola misura (Figura 2 D).25 Questo risultato è rappresentativo per le misure condotte con BSA purificato nel nostro laboratorio. Inoltre, abbiamo raffigurato i collegamenti trasversali trovati nella struttura di cristallo BSA e ha notato che la maggior parte delle distanze misurate erano ragionevoli. Soprattutto, i collegamenti trasversali mostrano una distanza media Cα-Cα tra gli aminoacidi reticolati di 22,1 Å e una distribuzione di distanza che è in perfetto accordo di ciò che è previsto per la reticolazione con un reagente che spazi gli esteri attivi di circa 9 Å (figure 2 E e S2) 26 e tenendo conto delle lunghezze delle catene laterali e la dinamica molecolare della proteina.27 La reticolazione si è verificata principalmente tra due residui Lys (49%), ma abbiamo anche rilevato connessioni Lys-Thr (30%), Lys-Ser (13%) e Lys-Tyr (8%), in accordo con la reattività dei succinimidil esteri (Figura 2 F).28

Questo successo ci ha permesso di validare il nuovo reticolante in un ambiente più complesso. In particolare abbiamo voluto mostrare il valore aggiuntivo della possibilità di arricchimento basata su CuAAC. Per questo esperimento, abbiamo nuovamente reticolato la proteina BSA (10 μg), precipitato con acetone, ridisciogliere la proteina reticolata e successivamente eseguito la reazione click (Figura S3 A) con l’aggiunta di 7 (Figura 3 A) e CuSO4/tris (3-hydroxypropyltriazolylmethyl) amina (THPTA) seguita dalla riduzione di CuII a CuI con l’aggiunta di ascorbato di sodio. Dopo 1 ora a temperatura ambiente, abbiamo eseguito un’altra precipitazione di acetone per rimuovere l’azide biotina in eccesso. Abbiamo poi aggiunto tripsina e Lys-C per la digestione.

Questi peptidi abbiamo poi combinato con un digest proteico ottenuto da un estratto di cellule HEK (435 μg di proteine; Figura 3 B). Questo crea uno sfondo massiccio di peptidi non crosslinked. Se ora abbiamo analizzato i crosslink all’interno di questo sfondo grande (Figura 3 C), abbiamo identificato solo un numero molto piccolo di crosslink corrispondenze spettrali (media CSMs = 5.0), siti unici crosslinked (media XLs unici = 3.7) così come monolink (media = 5.3), in cui un estere succinimidyl idrolizzato prima della reazione con la proteina. Tuttavia, se abbiamo eseguito l’arricchimento con perline magnetiche rivestite di streptavidina, il numero di identificazioni di crosslink è migliorato notevolmente. Dopo l’incubazione della miscela di peptidi con le particelle magnetiche; ampio lavaggio (6 ×) delle perline con tampone (vedi le informazioni di supporto) e mite, scissione riduttiva del disolfuro per liberare i crosslink “catturati” e quindi rimuovendo la biotina moiety (Figura S3 B), abbiamo ora, in media, rilevato 95,0 CSMs e 37,0 XLs unici insieme a 184,3 monolink. Il numero di XL unici identificati era inferiore a quello per il BSA purificato (Figura 2 D), che potrebbe essere spiegato da inefficienze nella reazione CuAAC o interferenza del complesso non crosslinked sfondo. Tuttavia, questo risultato dimostra che il nostro nuovo reticolante, 1, è in grado di arricchire i peptidi reticolati in un vasto eccesso di peptidi immodificati, facilitando così l’analisi di campioni complessi con crosslinks basso-abbondante. Originariamente, eravamo scettici circa la struttura asimmetrica di 1. I dati, tuttavia, mostrano che, nonostante questo, un gran numero di crosslinks sono identificati.

In sintesi, il nostro nuovo reticolatore 1 combina i seguenti vantaggi: in primo luogo, le dimensioni del reagente sono ideali per ottenere preziose informazioni di distanza per la proteomica strutturale. Inoltre, la molecola è permeabile alle cellule e l’unità alchinica non causa grandi interferenze con la reazione di reticolazione. Inoltre, la frammentazione robusta ed efficiente del sulfossido semplifica l’identificazione del crosslink. La possibilità di funzionalizzare i peptidi reticolati con 1 da chimica click permette diverse modifiche e strategie di arricchimento che consentono l’analisi di crosslink a basso contenuto di essere impiegato. Per concludere, il nostro reagente 1 ora apre la strada per l’analisi interactome complesso utilizzando MS2 e MS3 esperimenti.

Conflitto di interessi

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.