Typ-I-Isozyme

Wie aus Abb. 1 ersichtlich, dient Hexokinase als Tor, durch das Glc in alternative Stoffwechselwege gelangt. Dennoch ist es wahrscheinlich sicher, dass Hexokinase am ehesten als glykolytisches Enzym angesehen wird, und der glykolytische Stoffwechsel wird im Allgemeinen als zytoplasmatischer Prozess betrachtet. Daher war es bemerkenswert, dass im Gegensatz zu anderen glykolytischen Enzymen die Hexokinase-Aktivität (heute als Typ-I-Isozym bekannt) vorwiegend in „partikulären Fraktionen“ von Gehirnhomogenaten gefunden wurde (Crane und Sols, 1953). Spätere Arbeiten (Johnson, 1960; Rose und Warms, 1967; siehe auch Wilson, 1995) zeigten, dass die partikuläre Hexokinase mit Mitochondrien und insbesondere mit der äußeren Mitochondrienmembran assoziiert ist (Rose und Warms, 1967; Kropp und Wilson, 1970). Die Bindung hängt entscheidend von einer hydrophoben N-terminalen Sequenz ab (Polakis und Wilson, 1985), die das Typ-I-Isoenzym selektiv an Mitochondrien bindet (Gelb et al., 1992; Sui und Wilson, 1997) und im Zuge der Bindung in den hydrophoben Kern der äußeren Mitochondrienmembran eingefügt wird (Xie und Wilson, 1988). Porin (auch „VDAC“ genannt, das Akronym für „voltagedependent anion channel“) bildet den Kanal, durch den Metaboliten die äußere mitochondriale Membran durchqueren, und wurde als das äußere mitochondriale Membranprotein identifiziert, das mit Hexokinase interagiert (Felgner et al., 1979; Lindén et al., 1982; Fiek et al., 1982). Darüber hinaus gibt es Anhaltspunkte dafür, dass die Bindung von Hexokinase bevorzugt an Porin erfolgt, das sich an Kontaktstellen befindet, d. h. an Bereichen, in denen ein enger Kontakt zwischen der inneren und der äußeren Mitochondrienmembran besteht (Dorbani et al., 1987;Kottke et al., 1988;Beltrandel-Rio und Wilson,1992a).

Den klassischen Studien von Johnson(1960) und von Rose und Warms(1967) folgten bald Berichte über mitochondrial gebundene Hexokinase aus anderen normalen Geweben, zusätzlich zum Gehirn, sowie aus verschiedenen Tumorzellen (für Referenzen, siehe Wilson, 1985,1995). Über die mögliche physiologische Bedeutung dieser Verbindung eines „glykolytischen“ Enzyms mit den Mitochondrien, dem primären Ort des oxidativen Stoffwechsels, wurde viel spekuliert. Von Anfang an und insbesondere nach der Erkenntnis, dass das „Hexokinase-Bindungsprotein“ der äußeren Mitochondrienmembran mit dem Porin identisch ist und somit die Hexokinase in der Nähe des Punktes positioniert sein könnte, an dem ATP die Mitochondrien verlässt (und ADP wieder in die Mitochondrien eintritt), Die Spekulationen konzentrierten sich weitgehend auf die Möglichkeit, dass diese Nähe eine enge metabolische Interaktion zwischen der intramitochondrialen oxidativen Phosphorylierung als Quelle von Substrat-ATP und der Glc-Phosphorylierung durch die mitochondrial gebundene Hexokinase fördern könnte. Dies wurde bereits von Rose und Warms (1967) in Erwägung gezogen, konnte aber durch ihre experimentellen Ergebnisse nicht bestätigt werden. Spätere Arbeiten anderer (siehe auch Wilson, 1985, 1995), die mitochondrial gebundene Hexokinase aus verschiedenen Quellen verwendeten, erbrachten jedoch Beweise für die Ansicht, dass mitochondrial gebundene Hexokinase „bevorzugten“ oder „privilegierten“ Zugang zu intramitochondrial erzeugtem ATP hat.

Die Arbeiten in unserem Labor haben eine solide Grundlage für die Ansicht geschaffen, dass die an aktiv phosphorylierende Hirnmitochondrien gebundene Hexokinase in der Tat eng an ein intramitochondriales Kompartiment von Substrat-ATP gekoppelt ist, das durch oxidative Phosphorylierung erzeugt wird. Die experimentelle Untermauerung dieser Schlussfolgerung wurde in einer Reihe von Veröffentlichungen beschrieben (BeltrandelRio und Wilson, 1991, 1992a, b; de Cerqueira Cesar und Wilson, 1995, 1998, 2002; Hashimoto und Wilson, 2000). Ein vollständiger Überblick über diese Arbeiten ist im Rahmen des vorliegenden Kontextes nicht möglich, aber wir werden einige der wichtigsten Ergebnisse hervorheben, um die Vielfalt der experimentellen Ansätze zu veranschaulichen, die alle zu den gleichen Schlussfolgerungen führen und in diesen Studien verwendet wurden.

Anfängliche Studien (BeltrandelRio und Wilson,1991,1992a,b) wurden mit spektrophotometrischen Methoden durchgeführt, bei denen die ATP-Produktion durch verschiedene intramitochondriale Prozesse (oxidative Phosphorylierung, Adenylatkinasereaktion, Kreatinkinasereaktion) und die Glc-Phosphorylierung durch Hexokinase mit der bei 340 nm überwachten NADPH-Produktion durch den Einsatz geeigneter Kopplungsenzyme verknüpft wurden. Der Grundgedanke war, dass man durch den Vergleich der Glc-Phosphorylierungsrate mit der ATP-Produktionsrate aus verschiedenen Quellen auf die relative Bedeutung verschiedener intramitochondrialer ATP-produzierender Prozesse als ATP-Substratquelle für die Hexokinase schließen kann. Die Schlussfolgerung war, dass bei der oxidativen Phosphorylierung weder die Adenylatkinase noch die Kreatinkinase eine bedeutende Quelle für Substrat-ATP darstellen. Darüber hinaus wurde nur ein Bruchteil des durch die oxidative Phosphorylierung erzeugten ATP von der Hexokinase verwertet, so dass die ATP-Konzentration im extramitochondrialen Medium mit Fortdauer der oxidativen Phosphorylierung weiter anstieg. Die Geschwindigkeit der Glc-Phosphorylierung nahm jedoch als Reaktion auf den fortgesetzten Anstieg des extramitochondrialen ATP nicht stetig zu, obwohl letzterer mit dem Km für ATP vergleichbar war, der bei Zugabe von extramitochondrialem ATP in Abwesenheit der oxidativen Phosphorylierung festgestellt wurde, d. h. die Hexokinase wäre mit extramitochondrialem ATP als Substrat nicht „gesättigt“ gewesen (Abb. 2). Dies deutet stark darauf hin, dass nicht das extramitochondriale ATP als Substrat verwendet wurde.

Weitere Unterstützung erhielt dies durch Ergebnisse wie die inAbbildung 3 gezeigten. Hier wurde die GlcPhosphorylierung nach Einleitung der oxidativen Phosphorylierung durch Zugabe von ADP überwacht, wobei von Anfang an steigende Konzentrationen von extramitochondrialem ATP vorhanden waren. Wie von der klassischen Michaelis-Mentenkinetik erwartet, stieg die anfängliche Rate der Glc-Phosphorylierung mit zunehmender extramitochondrialer ATP-Konzentration. Mit der Zeit wurde jedoch eine Steady-State-Rate der Glc-Phosphorylierung erreicht, die unabhängig von der Menge an vorhandenem restlichem extramitochondrialem ATP war. Diese Ergebnisse wurden dahingehend interpretiert, dass die mitochondrial gebundene Hexokinase zwar zunächst extramitochondriales ATP verwendete, die Einleitung der oxidativen Phosphorylierung jedoch zu einem Wechsel in der Substratpräferenz führte, wobei die Hexokinase von einem intramitochondrialen ATP-Kompartiment abhängig wurde, das durch die Rate der oxidativen Phosphorylierung bestimmt wurde und unabhängig vom Extramitochondrium war.

Obwohl die ATP-Produktion fast unmittelbar nach der Einleitung der oxidativen Phosphorylierung durch Zugabe von ADP begann, gab es eine deutliche Verzögerung bei der Einleitung der Glc-Phosphorylierung durch die mitochondrial gebundene Hexokinase (Abb. 3D), bevor eine Steady-State-Rate erreicht wurde, die über einen längeren Zeitraum anhielt. Diese anfängliche Verzögerungszeit wurde als die Zeit interpretiert, die erforderlich ist, um ein intramitochondriales Kompartiment mit ATP zu füllen, das durch oxidative Phosphorylierung erzeugt wurde und aus dem die mitochondrial gebundene Hexokinase ihr Substrat ATP bezog. Die Hemmung des Elektronentransports durch Zugabe von KCN führte zu einer offensichtlichen Freisetzung von ATP, vermutlich aus dem intramitochondrialen Kompartiment, und die Eigenschaften dieses „Kompartiments“ (Kinetik der Füllung, Verbindung zur intramitochondrialen ATP-Produktion usw.) stimmten zufriedenstellend mit den Erwartungen überein.Leider ist die Übereinstimmung mit den Erwartungen kein unfehlbarer Wegweiser zur Wahrheit, und die „scheinbare Freisetzung von ATP“ erwies sich später als Artefakt (Laterveer et al., 1993), dessen Ursache noch immer nicht geklärt ist und das in späteren Arbeiten nicht reproduziert werden konnte (deCerqueira Cesar und Wilson, 1998). Trotz dieses entmutigenden und peinlichen Rückschlags wurde das Grundkonzept der Kopplung von mitochondrial gebundener Hexokinase an ein intramitochondriales ATP-Kompartiment durch andere Beweise gestützt und hat späteren experimentellen Tests standgehalten.

Eine Methode zur doppelten Isotopenmarkierung wurde als Alternative zu den spektrophotometrischen Verfahren entwickelt (deCerqueira Cesar und Wilson, 1995). 14C-markiertes Glc wurde als Substrat für Hexokinase verwendet, und 32Pi lieferte ein Substrat für die ATP-Synthese durch oxidative Phosphorylierung. Das32P/14C-Verhältnis in Glc-6-P lieferte somit ein Maß für die spezifische Aktivität des von der Hexokinase verwendeten ATP-Substrats. Das32P/14C-Verhältnis von Glc-6-P, das von mitochondrial gebundener Hexokinase produziert wird, wurde mit dem von Hefe-Hexokinase verglichen, die nicht an Mitochondrien bindet und daher notwendigerweise extramitochondrialesATP als Substrat verwendet. Die Kinetik der Markierung der ATP-Pools, die von mitochondrial gebundenen Hexokinasen und Hefe-Hexokinasen als Substrat verwendet wurden, war auffallend unterschiedlich, was wiederum mit der Ansicht übereinstimmt, dass die mitochondrial gebundene Hexokinase kein extramitochondriales ATP als Substrat verwendet, sondern vielmehr auf ein intramitochondriales ATP-Kompartiment zurückgreift, das durch oxidative Phosphorylierung bereitgestellt wird.Zum Beispiel (Abb. 4) führte die Zugabe von überschüssigem 31Pi, wodurch die spezifische Aktivität des durch oxidative Phosphorylierung synthetisierten 32P-ATP deutlich verringert wurde, zu einer raschen Abnahme des 32P/14C-Verhältnisses des von der Hefe-Hexokinase unter Verwendung von extramitochondrialem ATP produzierten Glc-6-P. Im Gegensatz dazu ging das32P/14C-Verhältnis von Glc-6-P, das von mitochondrial gebundener Hexokinase produziert wurde, mit einer Verzögerung und anschließend etwas langsamer zurück. Die letztgenannten Beobachtungen stimmten wiederum mit der Ansicht überein, dass die mitochondriale Hexokinase ein intramitochondriales ATP-Kompartiment nutzte, das nicht frei mit extramitochondrialem ATP ins Gleichgewicht gebracht wurde.

Ein weiterer experimenteller Ansatz basiert auf einem Vergleich von mitochondrial gebundener Hexokinase und dem nicht gebundenen Hefeenzym (de Cerqueira Cesar und Wilson, 1998, 2002). Die zugrundeliegende Logik wird in Abb. 5 veranschaulicht. Eine feste Menge von Hirnmitochondrien mit gebundener Hexokinase wird mit zunehmenden Mengen von Rattenlebermitochondrien, die keine gebundene Hexokinase enthalten, gemischt. Sowohl die Hirn- als auch die Lebermitochondrien phosphorylieren aktiv, so dass die ATP-Produktionsrate im System mit zunehmender Menge an Lebendmitochondrien steigt. Die Konzentration von extramitochondrialem ATP ist so konzipiert, dass eine Untersättigung erreicht wird, d. h. ÅKm Hexokinas mit extramitochondrialem ATP als Substrat (ohne oxidative Phosphorylierung). Wenn die mitochondrial gebundene Hexokinase extramitochondriales ATP als Substrat verwendet, wird ein progressiver Anstieg der Glc-Phosphorylierungsrate erwartet, wenn die ATP-Produktionsrate durch die Zugabe zunehmender Mengen von Lebermitochondrien erhöht wird. Tatsächlich ist dies nicht der Fall; vielmehr wird die Geschwindigkeit der Glc-Phosphorylierung durch die an die Mitochondrien gebundene Hexokinase durch die Erhöhung der ATP-Produktionsrate nicht wesentlich beeinflusst (Abb. 6). Im Gegensatz dazu wird der erwartete Anstieg der Glc-Phosphorylierungsrate beobachtet, wenn die mitochondriale Hexokinase durch eine äquivalente Menge an Hefe-Hexokinase ersetzt wird. Diese Ergebnisse stimmen also wieder mit der Ansicht überein, dass die mitochondrial gebundene Hexokinase intramitochondriales ATP verwendet, das den Mitochondrien, mit denen die Hexokinase assoziiert ist, innewohnt, aber unabhängig von einem Anstieg des extramitochondrialen ATP ist, der von den hexokinasefreien Lebend-Mitochondrien ausgeht.

Schließlich liefert die Untersuchung der Hemmung durch das Glc-6-P-Analogon, 1,5-Anhydroglucitol-6-P(1,5-AnG6P), einen weiteren Beweis für die Ansicht, dass mitochondrial gebundene Hexokinase zwischen intra- und extramitochondrialem ATP unterscheiden kann. In Abwesenheit von oxidativer Phosphorylierung und mitxtramitochondrialem ATP als Substrat ist 1,5-AnG6P ein ziemlich starker Inhibitor, der gegenüber ATP konkurriert (Abb. 7) (Hashimoto und Wilson, 2000). Im Gegensatz dazu ist 1,5-AnG6P bei ATP, das durch oxidative Phosphorylierung bereitgestellt wird, als Inhibitor weit weniger wirksam. Offensichtlich ist das durch oxidative Phosphorylierung bereitgestellte ATP nicht gleichwertig mit dem extramitochondrialen ATP. Ähnliche Ergebnisse wurden kürzlich unter Verwendung der hexochondrialen Hexokinase aus Rinderhirn berichtet (de Cerqueira und Wilson, 2002).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die mitochondriale Hexokinase in Abwesenheit von oxidativer Phosphorylierung extramitochondriales ATP nach der klassischen Michaelis-Menten-Kinetik problemlos nutzen kann. Während der aktiven oxidativen Phosphorylierung ist das mitochondrial gebundene Enzym jedoch an einen intramitochondrialen ATP-Pool gekoppelt, wobei die Geschwindigkeit der Glc-Phosphorylierung eng mit der Geschwindigkeit der oxidativen Phosphorylierung korreliert.Es scheint schwer vorstellbar, dass sich Mitochondrien in normalem Gewebe jemals in einem völlig nicht-phosphorylierenden Zustand befinden. Änderungen der Rate? Ja, natürlich, je nach Schwankungen des Energiebedarfs. Aber wirklich nichtphosphorylierend? Wahrscheinlich nur unter den schlimmsten – und letztlich tödlichen – Umständen. Daraus folgt, dass die Geschwindigkeit der GlcPhosphorylierung unter normalen Bedingungen eng mit den oxidativen Endstufen des GlcStoffwechsels in den Mitochondrien und der damit verbundenen Produktion von ATP durch oxidative Phosphorylierung koordiniert ist. Wie bereits erwähnt (Beltrandel-Rio und Wilson, 1992a), kann eine solche Koordination die Einführung von Glc in den glykolytischen Stoffwechsel mit einer Geschwindigkeit gewährleisten, die den terminalen oxidativen Stadien entspricht, wodurch die Produktion von neurotoxischem Laktat vermieden wird (Marie und Bralet, 1991), während der Nettofluss durch den zytoplasmatischen und mitochondrialen Teil des Weges mit einer Geschwindigkeit gewährleistet wird, die den Energiebedarf deckt (Abb. 8).

Es ist nicht bekannt, wie diese bemerkenswerte Änderung der Substratspezifität (intramitochondriales gegenüber extramitochondrialem ATP) durch die oxidative Phosphorylierung induziert wird, aber es ist klar, dass die Konformation des an die Mitochondrien gebundenen Enzyms durch das mitochondriale Membranpotenzial sowie durch andere Faktoren im Zusammenhang mit der mitochondrialen Funktion beeinflusst wird, Dies deutet auf eine enge Interaktion zwischen der inneren (über die das Membranpotenzial verläuft) und der äußeren (an die die Hexokinase gebunden ist) Membran dieser Organelle hin (Hashimoto und Wilson, 2000).Konformationsänderungen in Bereichen des Moleküls, die an der Bindung von ATP-Substrat beteiligt sind, wurden bereits früher postuliert (de Cerquiera und Wilson, 1998), um für Änderungen der Substratspezifität verantwortlich zu sein.