γδ-szelekció

γδT sejtek keletkeznek a DN tímocitákból, mivel a TCRγ és δ láncok átrendeződése a DN szakaszokban történik . A γδ prekurzor sejtek, amelyekben a TCRγ és δ átrendeződött a TCRβ rekombináció előtt, γδTCR/CD3 komplexet expresszálnak a plazmamembránon, ahol a γδTCR önoligomerizálódik, mint a pre-TCR, és intracelluláris jelátviteli utakat indít el . Ez a γδTCR jel indukálja a “γδ-szelekciónak” nevezett folyamatot, amely megerősíti a funkcionális TCRγδ láncok keletkezését, így a sejt felismeri, hogy “én egy γδT sejt vagyok” .

A γδ-szelekciós jel elindítja a CD5- CD24magas γδ prekurzor sejtekből a CD5+ CD24alacsony γδT elkötelezett sejtekké történő differenciálódást . A CD5- CD5+ γδT sejtekből CD5+ γδT sejtekké való átmenet jelentősen károsodott Syk-hiányos egerekben, míg a Zap70-hiányos egerekben a CD5+ γδT sejtek differenciálódása normális. A Zap70/Syk kétszeresen hiányos egereknél a γδT sejtek differenciálódása teljesen leáll a CD5- prekurzor stádiumban . A γδ-szelekció tehát elsősorban a Syk által közvetített szignáltól függ, és a Zap70 csak kisebb és redundáns szerepet játszik ebben a folyamatban. Ez a mechanizmus teljesen analóg a β-szelekcióéval. A Syk egyik kritikus célpontja a γδ-szelekciós jelben a Lat szignáloszóma, mivel a Lat-hiányos egereknél a γδ-szelekció teljes gátlása és az érett γδT sejtek teljes hiánya figyelhető meg .

A Syk/Zap70-hiányos egerekből vagy Lat-hiányos egerekből származóγδ prekurzor sejtek a γδTCR kivételével a sejtfelszíni fehérjék expressziója alapján megkülönböztethetetlenek az αβT vonalú sejtektől, és továbbra is fenntartják a αβT sejtekké való differenciálódás lehetőségét. Mi határozza meg az αβT vagy γδT vonalba való differenciálódási sorsot a prekurzorból? Ezt a kérdést γδTCR transzgenikus egerekkel végzett vizsgálatokkal vizsgálták. Amikor a γδTCR jelet gyengítették akár a jelzőfehérjék, akár a transzgénikus γδTCR endogén ligandumainak hiánya miatt, a prekurzor sejtek αβT vonalú DP sejteket hoztak létre a γδT vonalú sejtek rovására . Ezek az eredmények arra utalnak, hogy egy erősebb jel (valószínűleg a γδTCR ligandum kölcsönhatásakor) vezet a γδT sejtek felé történő elköteleződéshez, míg egy gyengébb jel (valószínűleg ligand-független pre-TCR által) vezet az αβT differenciálódáshoz. Egy másik transzgenikus egértörzset használó, ugyanolyan ligand-specifitású γδTCR-t expresszáló egértörzzsel végzett kísérletek azonban azt mutatták, hogy a γδT sejtek a ligandok hiányában is képesek éretté válni. Chien és munkatársai tetramer festési módszert alkalmaztak a ligand-specifikus γδT sejtpopuláció azonosítására, hogy megvizsgálják az endogén γδTCR ligandumok jelentőségét nem transzgén egerekben. Az eredmények egyértelműen kimutatták, hogy a ligand-specifikus γδT sejtek száma összehasonlítható volt a ligand-ufficient és -deficient egerek között, ami arra utal, hogy a γδT sejtek többsége nem találkozott ligandokkal a thymus differenciálódás során . A szerzők bizonyítékot szolgáltattak arra is, hogy egyes γδTCR-ek ligand-függetlenül is képesek jelezni . Ezek a megfigyelések nyilvánvalóan ellentmondanak annak a korábbi modellnek, hogy a γδT vonalhoz kötődéshez γδTCR ligand kölcsönhatás szükséges. Mivel a poliklonális γδT sejtek, amelyek bizonyos exogén ligandokra reagálnak, differenciálódnak és funkcionálisan érnek a tímuszban, valószínű, hogy az egyes γδTCR transzgenikus egérvonalakon végzett megfigyelések nem tükrözik a poliklonális γδTCR-rel rendelkező γδT sejtek többségét.

A γδ-szelekciós jel αβT/γδT differenciálódásra gyakorolt hatásának vizsgálatához Lat-hiányos egereket használtunk, amelyekben a γδT sejtek differenciálódása a CD5- prekurzor stádiumban leáll. A γδTCR+ prekurzor sejteket felnőtt Lat-hiányos egerekből tisztítottuk, Lat-ot expresszáló retrovírussal fertőztük, és stromasejt monolayeren tenyésztettük (2a. ábra). Ez a kísérlet lehetővé teszi a sejtfenotípus közvetlen értékelését a γδ-szelekció előtt és után, ligandummentes körülmények között. A nem transzdukált kontrollsejtekhez képest a Lat-expresszáló γδT sejtek a CD5 felszíni expressziójának kifejezett indukcióját mutatták (2b. ábra), valamint a γδT sejtek szignatúra génjeinek (Tcrd, Egr3, Runx3 és Bcl-2) mRNS-expresszióját, és a prekurzor DN sejtekhez és αβT sejtekhez kapcsolódó gének (Rag1, Rag2 és Ptcra) transzkripciójának teljes megszűnését (2c. ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a γδTCR jel egyszerre irányítja a differenciálódást a γδT vonal felé és nyomja el az αβT vonalba való differenciálódást ligand-független módon.

Összességében, bár a mechanizmusok, amelyek révén a pre-TCR és a γδTCR az αβT, illetve a γδT vonalba való differenciálódási folyamatokat irányítja, még mindig nehezen meghatározhatóak (és vitatottak), valószínű, hogy a γδ-szelekció, legalábbis a természetesen keletkezett γδT sejtek többségében, nem függ a tímuszban lévő rokon γδTCR ligandtól.

γδTCR jelerősség határozza meg a γδT17/γδT1 differenciálódást

Az αβT és a γδT vonal fejlődése során a Syk és a Zap70 expressziója fordítottan szabályozott: A Syk a korai szakaszokban (DN1-3 és γδ prekurzor) nagymértékben expresszálódik, majd ezt követően visszaszorul, míg a Zap70 a későbbi szakaszokban (β-szelekció vagy γδ-szelekció után) expresszálódik . A γδ-szelekción átesett γδT sejtek magas szinten expresszálják a Zap70-et, valamint a γδTCR/CD3 komplexeket, és képesek reagálni az endogén ligandokra, ha azokat a tímuszban biztosítják. Jelenleg elismert tény, hogy az αβT sejtekkel ellentétben a γδT sejtek nem mennek keresztül ligandvezérelt pozitív szelekción vagy klonális deléción a tímuszban. Számos tanulmány azt sugallta, hogy a γδTCR ligandum kölcsönhatása a timuszban ehelyett a γδT sejtek effektor funkcióját szabályozza.

A nem-klasszikus MHC I. osztályú T10 és T22 molekulákkal szemben reaktív γδT sejtpopuláció tetramer festését alkalmazva Chien csoportja azt találta, hogy a ligandok hiányában kifejlődött antigén-naiv γδT sejtek elsősorban IL-17-et, míg a ligandok jelenlétében kifejlődött antigén-tapasztalt γδT sejtek túlnyomórészt IFNγ-t termeltek. Ez a vizsgálat vetette fel először azt az elképzelést, hogy a ligandok által indukált erős γδTCR jel és a gyenge γδTCR jel γδT1, illetve γδT17 sejteket indukál. Egy nemrégiben újonnan létrehozott T10/T22-hiányos egerekkel végzett vizsgálat lényegében ugyanezekről az eredményekről számolt be, alátámasztva ezt a “jelerősség-modellt” . Ezt a modellt más vizsgálatok is alátámasztották. A Vγ5Vδ1 γδT sejtek tímiás éréséhez és effektor differenciálódásához Skint1 (és valószínűleg más Skint családba tartozó fehérjék) szükséges, amely a Vγ5Vδ1 TCR feltételezett kostimuláló fehérjéje . Skint1 hiányában a Vγ5Vδ1 γδT sejtek a γδΤ17 sejt fenotípusra tévednek a γδΤ1 sejt fenotípus rovására . Továbbá, a γδT1 sejtek fejlődéséhez a CD27-en, egy TNF-receptor szupercsaládba tartozó fehérjén keresztül történő költségstimuláció is szükséges, amely a γδT1 sejtekben expresszálódik, de a γδT17 sejtekben nem . Pennington csoportja nemrégiben azonosította a tímiás bipotens γδT sejteket (CD24lo CD44lo CD44lo CD45RBlo), amelyekből γδT17 sejtek és γδT1 sejtek egyaránt keletkezhetnek. Magzati thymus szervkultúrában a γδT17 sejtek fejlődését gátolták az anti-TCRδ vagy anti-CD3ε antitestekkel történő stimuláció által kiváltott erős TCR jelek, de ezeket a hatásokat a MEK/ERK útvonal farmakológiai gátlása megszüntette. Ezek az adatok közvetlen bizonyítékot szolgáltatnak annak alátámasztására, hogy a γδTCR jel erőssége a γδT sejtek effektor funkciójának kritikus meghatározója.

Transzkripciós szinten az erős γδTCR jel a γδT1-hez kapcsolódó transzkripciós regulátorok, mint az Egr2, Egr3 és Id3 expresszióját indukálja, ami a γδT1 sejtsorsot eredményezi . Az Id3 gátolja a γδT17 sejtsors elfogadását a HEB által közvetített (Tcf12 által kódolt) transzkripciós szabályozás gátlásával . A HEB közvetlenül a Sox4 és Sox13 transzkripciós starthelyeihez tud kötődni, hogy elősegítse expressziójukat. Ezek a γδT17-hez kapcsolódó transzkripciós faktorok szükségesek a RORγt (Rorc által kódolt) esszenciális transzkripciós faktor és a Blk jelátviteli fehérje kifejeződéséhez. Ezeket a tényeket figyelembe véve a TCR jelerősség modellje egyértelműen bemutatja azokat a mechanizmusokat, amelyekkel a TCR jel a γδT sejtek effektor funkcióját szabályozza.

Vizsgálatok sorozata azonban kimutatta a TCR jelátviteli molekulák genetikai ablációjának hatását a γδT sejtek effektor funkciójára, megkérdőjelezve azt az elképzelést, hogy a γδTCR jelerőssége önmagában meghatározza a γδT17/γδT1 differenciálódási sorsát. A Zap70 W163C mutáns egerek a Vγ6+ γδT17 sejtek fejlődésének teljes elvesztését mutatják, de a γδT1 sejtek fejlődése normális, miközben a TCR jelek tompulnak ezekben az egerekben . Silva-Santos és munkatársai egy másik vizsgálatukban kimutatták, hogy a CD3δ és CD3γ (CD3DH) szempontjából haploinsufficient egereknél a γδTCR/CD3 komplexek alacsonyabb sejtfelszíni expressziója és károsodott γδTCR jelátvitel volt megfigyelhető, a Vγ6+ γδT17 sejtek, valamint a γδT1 sejtek kifejezett csökkenését mutatták, de a Vγ4+ γδT17 sejtekét nem, ami azt jelzi, hogy a γδT17 alcsoportok eltérő γδTCR jelerősséget igényelnek fejlődésükhöz. Bár az αβT-sejtek fejlődése és az αβTCR jelátvitel nem befolyásolta a CD3DH egereket, ez az egértörzs az egyetlen olyan állatmodell eddig, amelyben kimutatták a γδTCR jelátvitel specifikus gátlását. Továbbra is tisztázatlan, hogy a CD3DH egerekben miért érintettek specifikusan a γδT sejtek, de valószínű, hogy a TCR-CD3 komplexek αβT és γδT sejtek eltérő összetétele magyarázza a CD3DH egerek egyedi fenotípusát. Ebben az összefüggésben meg kell jegyezni, hogy a CD3ε C80G mutációval rendelkező egerek, amelyek nem képesek konformációs változásokat indukálni a TCR-ben, szintén károsodott γδT17 sejtek, de normális γδT1 sejtek fejlődését mutatják .

A Syk szükséges a γδT17 differenciálódáshoz

A közelmúltban egy új szabályozási mechanizmusról számoltunk be, amelynek révén a γδTCR-proximális kinázok Syk és Zap70 differenciáltan szabályozzák a γδT17 indukciót . Syk-hiányos egereknél a γδT17 sejtek (mind a Vγ4+, mind a Vγ6+ alcsoportok) teljes elvesztése figyelhető meg a tímuszban. Figyelemre méltó, hogy a Zap70 erőltetett expressziója a Syk-hiányos T-progenitor sejtekben nem állította helyre a γδT17 sejtgenerációt, ami arra utal, hogy a Syk nem redundáns szerepet játszik a γδT17 differenciálódásban. Mivel a Syk-, de nem Zap70-hiányos γδT-sejtek a γδTCR-stimuláció által indukált Akt-foszforiláció jelentős csökkenését mutatják, ez arra utal, hogy a Syk közvetíti a PI3K-Akt útvonal γδTCR-indukált aktivációját. A PI3K-hiányos egerek (p110γ-/- p110δ-/-) a γδT17 sejtek fejlődésének teljes gátlását mutatják, de nem befolyásolják a γδ-szelekciót (CD5-felreguláció) vagy a γδT1 fejlődését. Kimutatták, hogy a PI3K gátlása csökkenti a γδT17-hez kapcsolódó transzkripciós faktorok (Rorc, Sox13 és Sox4) expresszióját, ami a PI3K-Akt útvonal döntő szerepére utal a γδT17 differenciálódási program indukálásában. Ezzel összhangban egy korábbi jelentés kimutatta, hogy a kináz-inaktív PI3Kδ vagy PI3Kγ-hiányos egereknél jelentősen csökken a perifériás γδT17-sejtek száma és javul a γδT17-függő gyulladás . A PI3K-Akt útvonal az IL-17-termelő αβT (Th17) sejtek differenciálódásához is szükséges, ami arra utal, hogy ez a jelátviteli útvonal az αβT és γδT vonal közös szabályozási mechanizmusa az IL-17-termelő proinflammatorikus alcsoportok indukálásához.

γδTCR által indukált PI3K-Akt jelátviteli útvonal aktiválása a Syk-tól függ, de nem a Lat-tól, ami arra utal, hogy a Syk a γδ-szelekciót indukáló Lat-függő főáramú jelátviteli útvonalon kívül a γδ-t17 differenciálódást kiváltó PI3K-Akt útvonalat is hajtja . Nem világos, hogy a Syk közvetlen kölcsönhatás révén vagy közvetett módon aktiválja-e a PI3K/Akt útvonalat a γδT sejtekben. Egy korábbi tanulmány arról számolt be, hogy a Rasgrp1-hiányos egerek a PI3K-hiányos egerekhez hasonló γδT-sejt effektor fenotípust mutatnak (azaz a γδT17 sejtek csökkenését és a γδT1 sejtek növekedését) . Mivel a Rasgrp1 a PI3K/Akt útvonal upstream aktivátoraként működhet az αβTCR jelátvitelben , valószínű, hogy a Rasgrp1 a γδTCR-től a PI3K felé továbbítja a jeleket a γδT17 differenciálódás indukálása érdekében.

A γδT17 sejtek preferenciális elvesztéséről számoltak be Blk hiányos egerekben is, amely egy Src családba tartozó kináz, amely a γδT sejtekben és a B sejtekben is kifejeződik, bár funkciója a γδTCR jelátvitelben ismeretlen .

A Zap70 bizonyos γδT sejt alcsoportokat irányít

A Zap70 szerepét a γδT sejtek thymus differenciálódásában is kimutattuk . A Zap70-hiányos egerek a Vγ6+ sejtek kifejezett csökkenését mutatják, amelyek többsége γδT17, de más γδT sejtek, beleértve a Vγ1+, valamint a Vγ4+ alcsoportok kialakulását nem befolyásolják. Valóban, a Zap70 fehérje expressziós szintje a γδT sejtek közül a Vγ6+ alcsoportban volt a legmagasabb. Mivel a CD5 expressziója alacsonyabb volt a Zap70-hiányos Vγ6+ sejtekben, mint a kontroll sejtekben, a Zap70-re valószínűleg szükség van a Vγ6+ sejtek timsóéréséhez. Kísérleteinkben a Zap70-hiányos egereknél a Vγ4+ sejtek, beleértve a γδT17 alcsoportot is, normálisan differenciálódtak a thymusban, ami ellentmond annak a korábbi jelentésnek, amelyben egy hipomorf Zap70 mutáció a thymus Vγ4+ γδT17 sejtek csökkenését okozta . Ez az eltérés a két vizsgálatban használt egerek különbözőségéből adódhat (Hayday csoportja hipomorf Zap70 mutáns egereket használt BALB/c háttéren, míg mi teljes Zap70-hiányos egereket használtunk C57BL/6 háttéren). Ezenkívül a Zap70-hiányos egereknél jelentősen csökkent a perifériás Vγ4+ sejtek száma, amelyek mind a γδT17, mind a γδT1 alcsoportokat magukban foglalták, de a Vγ1+ sejtek nem voltak károsodva. Így, ellentétben az αβT sejtek fejlődésében betöltött alapvető szerepével, a Zap70 szükséglete a Vγ6+ sejtek thymusi érésére és a Vγ4+ sejtek perifériás fenntartására korlátozódik.

A Zap70 és a Syk eltérő szerepére vonatkozó eredményeink új támpontot adhatnak a γδTCR jelátvitel és a γδT sejtek fejlődésének mechanizmusai megértéséhez. A Zap70 szükséges az αβTCR jelátvitelhez és a γδTCR jelátvitelhez bizonyos γδT sejtalcsoportokban. Az αβT sejtekben a Zap70 aktiválása az Lck-től függ, amely az antigénprezentáló sejtek felszínén lévő pMHC-hez kötődő CD4 vagy CD8 coreceptorokhoz kapcsolódik . Így feltételezhető, hogy az Lck-Zap70 egy olyan jelátviteli tengely, amely a sejt-sejt kontaktus által elért antigénfelismerésre specializálódott; bár a γδT sejtek esetében továbbra sem világos, hogy a CD4 és CD8 expresszió hiánya ellenére hogyan aktiválódik a Zap70. Ezzel szemben a Syk az immunreceptorok széles skálájához társul, beleértve a pre-TCR-t, γδTCR-t, BCR-t és FcR-t is. Mivel a Syk képes foszforilálni az ITAM-okat és a downstream célpontokat a Src-család kinázaitól, például az Lck-től függetlenül, ezek a receptorok ligand-függetlenül vagy különféle szolubilis, illetve sejtfelszíni antigénekhez való kötődést követően aktiválódhatnak. Így a Syk vagy a Zap70 felhasználása az immunreceptorok jelátvitelében meghatározhatja, hogy a receptor hogyan ismeri fel az antigént. Valóban, a Zap70 helyett a Syk expressziója az αβT sejteket képessé tette arra, hogy reagáljanak az oldható anti-CD3 antitest stimulációra, míg a normál αβT sejtek csak a sejtfelszíni pMHC-vel való kölcsönhatást utánzó multimerizált anti-CD3 antitestekre reagáltak. Ezek az eredmények arra ösztönöztek bennünket, hogy feltételezzük, hogy a limfociták által használt antigénfelismerési módot nemcsak a receptoruk önmagában, hanem a Syk-család kinázainak eltérő használata is meghatározhatja. Ezen elképzelés alapján azt jósoljuk, hogy vannak endogén sejtfelszíni γδTCR ligandumok, amelyek szükségesek a Vγ6+ sejtek tímiás éréséhez, valamint a Vγ4+ sejtek perifériás fenntartásához, és hogy a Vγ1+ sejteknek nincs szükségük sejtfelszíni γδTCR ligandumokra a fejlődésükhöz és/vagy fenntartásukhoz.

γδTCR-független és -függő folyamatok a γδT17 indukciójában

Egy közelmúltbeli jelentés elegánsan kimutatta, hogy a γδT17 sejtek a többi γδT sejtalcsoporttól eltérő progenitorból erednek . Arról számoltak be, hogy magzati eredetű, intrathymikus progenitorokat, amelyek magas szinten expresszálják a Sox13-at, azonosítottak egy korábban DN1d (CD44+CD25-c-kit-CD24hi) timocitáknak kategorizált populációban. Ezek a Sox13+ progenitorok preferenciálisan γδT17 sejteket hoztak létre a rekonstituált magzati tímuszban, míg a DN2 populáción belüli más progenitorok nem. A legfontosabb, hogy a Sox13+ progenitorok kimutathatóak voltak, és γδT17 vonalprogramjuk intakt volt TCRδ-hiányos vagy Rag-hiányos egerekben, ami azt jelzi, hogy a γδT17 vonal sorsa egy sejtintrinsikus, γδTCR-független mechanizmus révén “előre be van drótozva”. Egy korábbi jelentés azonban kimutatta, hogy a γδT17 sejtek képesek a DN2 stádiumból (CD44+CD25+c-kithi) kifejlődni, ha Notch ligandot expresszáló stromasejtek monorétegén együtt tenyésztik őket. Szükség lehet tehát a γδT sejtek fejlődésében a differenciálódási stádiumok és a progenitor-deszcendens kapcsolatok újradefiniálására.

A 3. ábra összefoglalja a γδT sejtek, valamint az αβT sejtek differenciálódási folyamatait, kiemelve az αβ/γδTCR jelek és a Syk család kinázainak követelményében mutatkozó különbségeket. A differenciálódás korai lépéseit, azaz az αβT sejtvonal β-szelekcióját és a γδ-szelekciót a γδT sejtvonalhoz a ligand-független pre-TCR vagy γδTCR jelátvitel vezérli, amely ellenőrző pontként szolgál a funkcionális TCRβ láncot, illetve γδTCR láncot expresszáló sejtek számára. Ezeket a ligand-független receptorjelzéseket a Syk indítja el, amely a DN timocitákban expresszálódik, beleértve a γδT prekurzorokat is. A γδT sejtvonalban a Syk által közvetített γδTCR jel szintén szükséges a γδT17 sejtek differenciálódásának elindításához a PI3K útvonal aktiválásán keresztül. Mind a β-szelekció, mind a γδ-szelekció során a Syk és a Zap70 expressziója fordítottan szabályozott: A Syk lefelé, míg a Zap70 felfelé szabályozódik pre-TCR vagy γδTCR szignál hatására. Ezért az αβT vonal differenciálódásának későbbi lépése a Zap70 által közvetített αβTCR jelátviteltől függ, amely lehetővé teszi a DP timociták számára, hogy felismerjék a pMHC-t a TEC-ek felszínén, hogy az αβTCR-pMHC kölcsönhatás erősségétől függően pozitívan vagy negatívan szelektálódjanak. Ezzel szemben a Zap70 által közvetített γδTCR jelátvitel endogén ligandumokra adott válaszként határozza meg a γδT sejtek effektor funkcióját: az erős jel a γδT1-et, míg a gyenge/nincs jel a γδT17-et indukálja.