A röntgensugarak kölcsönhatása a kristályban lévő elektronokkal diffrakciós mintázatot eredményez, amely matematikailag az elektronsűrűség-eloszlás Fourier-transzformációja. A röntgensugárzás mérésére használt detektorok azonban csak a diffraktált röntgensugárzás amplitúdóját képesek mérni; a fáziseltolódások, amelyek a Fourier-transzformáció használatához és az elektronsűrűség-eloszlás megtalálásához szükségesek, ezzel a módszerrel közvetlenül nem mérhetők. Ezt a fizikusok körében “fázisproblémának” nevezik. Egyszerűbben fogalmazva a fázisokat nem lehet a röntgensugarak mért amplitúdójából megállapítani. Más extrapolációkat kell végezni, és további kísérleteket kell végezni ahhoz, hogy elektronsűrűségtérképet kapjunk. Sokszor a vegyület fizikai és kémiai tulajdonságaira vonatkozó meglévő adatok segíthetnek, ha a sűrűségtérkép gyenge. Egy másik, Patterson-szintézis néven ismert módszer nagyon hasznos a fázisok kezdeti becslésének megállapításához, és nagyon hasznos a fehérjék szerkezetének meghatározásának kezdeti szakaszában, amikor a fázisok nem ismertek. A probléma leegyszerűsíthető úgy, hogy a Patterson-szintézis segítségével megkeresünk egy atomot, általában egy nehézfémet, majd az atom helyzetét felhasználva megbecsüljük a kezdeti fázisokat, és kiszámítunk egy kezdeti elektronsűrűségtérképet, amely tovább segíthet a többi atom helyzetének modellezésében, és még jobban javíthatja a fázisbecslést. Egy másik módszer az úgynevezett molekuláris helyettesítés; ez a fehérjeszerkezet helyét keresi meg a sejtben. A molekuláris helyettesítési módszer mellett a fázisprobléma megoldható az izomorf helyettesítési módszerrel, a több hullámhosszú anomális diffrakciós módszerrel, az egyhullámhosszú anomális diffrakciós módszerrel és a direkt módszerekkel is.

Molekuláris helyettesítésSzerkesztés

A fázisprobléma megoldható, ha van egy olyan atomi modell, amely képes fázisok kiszámítására. Modell akkor kapható, ha a kapcsolódó fehérjeszerkezet ismert. Ahhoz azonban, hogy ezt az atomi modellt felépítsük, meg kell határozni a modell orientációját és helyzetét az új egységcellában. Ekkor jön a képbe a technika, a molekuláris helyettesítés (vagy MR).

A molekuláris helyettesítés, más néven MR, a röntgenkrisztallográfiában a fázisproblémák megoldására szolgáló módszer. Az MR egy olyan fehérjeszerkezet orientációját és helyzetét keresi meg annak egységcellájával, amelynek fehérjeszerkezete homológ a meghatározandó ismeretlen fehérjeszerkezettel. A kapott fázisok segítségével elektronsűrűségtérképek készíthetők, és a röntgenkrisztallográfiás kísérletből megfigyelt struktúrákhoz tartozó fehérjeszerkezet-modell helyzetének számított intenzitásai állíthatók elő.

A MR-módszer makromolekuláris kristályszerkezetek megoldására is hatékony. Ez a módszer kevesebb időt és erőfeszítést igényel a szerkezetmeghatározáshoz, mivel nem kell nehézatom-származékokat készíteni és adatokat gyűjteni. A módszer egyszerű és a modellépítés leegyszerűsödik, mivel nincs szükség lánckövetésre.

Ez a módszer két lépésből áll:

1. egy rotációs keresés a homológ modell orientálására az egységcellában vagy a célpontban
2. egy transzlációs célpont, ahol az új orientált modellt elhelyezzük az egységcellában

Patterson-alapú (molekuláris helyettesítés)szerkesztés

A Patterson-térképek olyan atomok közötti vektortérképek, amelyek az egységcellában minden kapcsolódó atomhoz csúcsokat tartalmaznak. Ha a Patterson-térképeket az elektronsűrűség-térképekből származó adatok alapján generáltuk, akkor a két Patterson-térképnek csak akkor kell szorosan kapcsolódnia egymáshoz, ha a modell helyesen van orientálva és a megfelelő pozícióba helyezve. Ez lehetővé teszi, hogy információt következtessünk az ismeretlen fehérjeszerkezet cellával való elhelyezkedésére. A molekulapótlással azonban van egy probléma, hat dimenziója van, három paramétere van az orientáció és a pozíció megadására. A Patterson-térképekkel a paraméterek részhalmazaira bontható, hogy az egyes részeket külön-külön vizsgálhassuk.

Rotációs függvénySzerkesztés

A rotációs függvénynek olyan molekulán belüli vektorai vannak, amelyek csak a molekula orientációjától függnek, a pozíciójától nem, mert még ha a molekula az egységcellában el is van tolva, minden atom ugyanannyit tolódik, de az atomok közötti vektorok ugyanazok. Az ismeretlen fehérjeszerkezet Patterson-térképét összehasonlítjuk a homológ ismert fehérjeszerkezettel különböző orientációkban

Klasszikus forgatási függvénySzerkesztés

Az orientáció megtalálásához határozzuk meg a forgástengelyt és a tengely körüli forgatási szöget. A tengely meghatározásához két paraméterre lesz szükség (a gömb középpontjától a gömbfelület egy pontjáig tartó vektor). A forgástengely a z tengellyel párhuzamosan indul, és az y tengely körül ᶱ szöggel forog, majd az objektum a z tengely körül ᶲ szöggel forog, végül a forgástengely körül ᵠ szöggel forog. Ezek egy egységgömb felületének egy pontját adják meg.

Fast Rotation FunctionEdit

A forgásfüggvényt két Patterson-térkép vagy az azokban lévő csúcsok összehasonlításával lehet kiszámítani. A rotációs függvény Fourier-transzformációval csak akkor számítható sokkal gyorsabban, ha a Pattersonokat gömbharmonikusokban fejeznénk ki.

Direkt rotációs függvénySzerkesztés

A direkt rotációs függvényben a fehérjeszerkezetet az ismeretlen szerkezet egységcellájába lehet helyezni, és az orientált molekula Pattersonját a teljes ismeretlen szerkezet Pattersonjával kell összehasonlítani.

Translation FunctionEdit

Mihelyt az ismert szerkezet orientációja ismert, annak modellje (elektronsűrűségtérkép) orientálható a szerkezeti faktorok kiszámításához, ahol egy korrelációs függvény segítségével meghatározható az aszimmetrikus egységen belül a homológ modell tetejére fordítandó vektor.

A fehérjeszerkezet helyes orientált és fordított fázismodelljeivel elég pontos ahhoz, hogy a levezetett fázisokból levezesse az elektronsűrűségtérképeket. Az elektronsűrűségtérképek felhasználhatók az ismeretlen szerkezet modelljének felépítéséhez és finomításához.

Több hullámhosszú anomális diffrakcióSzerkesztés

Az X-sugarakat szinkrotronoknak nevezett nagy gépekben állítják elő. A szinkrotronok az elektronokat közel fénysebességre gyorsítják, és egy nagy, üreges fém poligongyűrűn keresztül vezetik őket. Minden egyes sarkon mágnesek hajlítják meg az elektronáramot, ami energiakibocsátást okoz elektromágneses sugárzás formájában. Mivel az elektronok fénysebességgel mozognak, nagy energiájú röntgensugárzást bocsátanak ki.

A szinkrotronok használatának előnye, hogy a kutatóknak nem kell minden kristályosított molekula több változatát növeszteniük, hanem csak egyféle, szelént tartalmazó kristályt kell növeszteniük. Ezután lehetőségük van arra, hogy a szelén kémiai tulajdonságaihoz igazítsák a hullámhosszt. Ezt a technikát több hullámhosszú anomális diffrakciónak nevezik. A kristályokat ezután többször bombázzák különböző hosszúságú hullámhosszokkal, és végül olyan diffrakciós mintázat alakul ki, amely lehetővé teszi a kutatók számára a szelénatomok helyének meghatározását. Ezt a pozíciót referenciaként vagy jelölőként lehet használni a szerkezet többi részének meghatározásához. Ennek előnyei lehetővé teszik a kutatók számára, hogy sokkal gyorsabban gyűjtsék az adataikat.

Izomorf helyettesítő módszerSzerkesztés

Ez a módszer összehasonlítja a röntgendiffrakciós mintázatokat az eredeti fehérjekristály és az azonos típusú kristály között, legalább egy magas atomszámú atom hozzáadásával. A módszert Max Ferdinand Perutz (1914-2002) használta kis molekulák és végül a hemoglobin szerkezetének meghatározására. Tökéletes izomorfizmusról akkor beszélünk, ha az eredeti kristály és származéka pontosan azonos fehérje-konformációval, a molekulák helyzetével és orientációjával, valamint az egységsejt paramétereivel rendelkezik. A tökéletes izomorfizmusban a kristály és a származék egyetlen különbsége a nehézatomok hozzáadásából adódó intenzitáskülönbség a származékon. Ezek a különbségek manuálisan vagy automatikus Patterson keresési eljárással, mint például a SIR 2002, SHELXD, nB és ACORN, azonosíthatók, és ezek az információk fontosak a fehérje fázisszögeinek meghatározásához. Tökéletes izomorfizmus azonban aligha fordul elő a sejtméretek változása miatt. A nehézatomos fehérje esetében a celladimenzió tolerálható változása dmin/4, mert dmin a felbontási határérték. Más tényezők, például a forgás is hozzájárulnak a nem izomorfizmushoz.

EljárásokSzerkesztés

1. Készítsünk néhány származékot a kristályos szerkezetű fehérjéről. Ezután mérjük meg a cellaméretet az izomorfizmus ellenőrzéséhez.
2. Gyűjtsük össze az eredeti fehérje és származékának röntgenintenzitási adatait.
3. Alkalmazzuk a Patterson-függvényt a nehézatom koordinátáinak meghatározásához.
4. Finomítsuk a nehézatom paramétereit és számítsuk ki a fehérje fázisszögét.
5. Kalkuláljuk ki a fehérje elektronsűrűségét.

A származékok két különböző módszerrel készülnek. Az előnyben részesített módszer a fehérjekristály áztatása az anyalúggal azonos összetételű oldatban, de a kicsapószer koncentrációjának kismértékű növelésével. A másik módszer az együttkristályosítás, de ezt nem szokták alkalmazni, mert a kristály nem nő vagy nem izomorf módon növekszik. Az áztatási eljárás attól függ, hogy milyen szélesek a kristály pórusai. A pórusoknak elég tágaknak kell lenniük ahhoz, hogy a reagens be tudjon diffundálni a kristályba, és elérje a kristályban lévő összes fehérjemolekula felületén lévő reaktív helyeket.

Multiple Wavelength Anomalous Diffraction MethodEdit

A Multiple Wavelength Anomalous Diffraction (rövidítve MAD) a röntgenkrisztallográfiában alkalmazott módszer, amellyel biológiai makromolekulák, például fehérjék és DNS szerkezetét tudjuk meghatározni a fázisprobléma megoldására. A szerkezetre vonatkozó követelmények közé tartoznak azok az atomok, amelyek jelentős szórást okoznak a röntgensugárzásból; nevezetesen a metalloproteinek kén- vagy fémionjai. Mivel a szelén helyettesítheti a természetes ként, gyakrabban használják. Ennek a technikának az alkalmazása nagyban megkönnyíti a kristályosító számára a MIR (Multiple Isomorphous Replacement) módszer alkalmazását, mivel a nehéz vegyületek előállítása felesleges.

Ezt a módszert fázisproblémák megoldására használják, amikor az amplitúdókon kívül nem állnak rendelkezésre adatok a szórt diffrakcióra vonatkozóan. Továbbá akkor alkalmazzák, ha egy nehézfématom már a fehérje belsejében van megkötve, vagy ha a fehérjekristályok nem izomorfak, ami alkalmatlan a MIR-módszerhez. A módszert többnyire nehézfémallo-oldatokra használták, ezek a fémallo-enzimek általában az 1. átmeneti sorozatból és szomszédaikból származnak. fontos, hogy legyen egy erős mágneses tér forrása a kísérlet elvégzéséhez, olyan környezetet, mint a földalatti, figyelembe kell venni. A módszerhez egy részecskegyorsító, úgynevezett szinkrotron is szükséges.

Egyhullámhosszú anomális diffrakciós módszerSzerkesztés

A több hullámhosszú anomális diffrakcióval (MAD) szemben az egyhullámhosszú anomális diffrakció (SAD) egyetlen hullámhosszról származó egyetlen adatsort használ. A MAD és az SAD közötti fő előnyös különbség az, hogy az SAD esetében a kristály kevesebb időt tölt a röntgensugárban, ami csökkenti a molekula lehetséges sugárkárosodását. Továbbá, mivel az SAD csak egy hullámhosszt használ, időhatékonyabb, mint a MAD.

Az egy hullámhosszú anomális diffrakciós adatokból származó elektronsűrűségtérképeket módosítani kell a fázistévesztések feloldása érdekében. Az egyik leggyakoribb módosítási technika az oldószeres lapítás, és amikor az SAD-et oldószeres lapítással kombinálják, az így kapott elektronsűrűség-térképek hasonló minőségűek, mint a teljes MAD-fázissal kapott térképek. Az oldószer-simítás az oldószer által elfoglalt fehérjemolekulák közötti interstitiális régiók elektronsűrűségének beállítását jelenti. Az oldószer régióját a fehérjéhez képest viszonylag rendezetlennek és jellegtelennek feltételezzük. Az oldószeres régiók elektronsűrűségének simítása értelmezhető mértékben növeli a fehérje elektronsűrűségét. Ezt a módszert ISAS-nak, iteratív egyhullámú anomális szórásnak nevezik.

Közvetlen módszerekSzerkesztés

A közvetlen módszer a kapott adatok segítségével segíthet a fázisok visszanyerésében. A direkt módszer egy hármas összefüggés segítségével becsüli a kezdeti és a táguló fázisokat. A hármas (trió) reláció egy reflexió intenzitásának és fázisának kapcsolata két másik intenzitással és fázissal. E módszer alkalmazásakor a fehérjeszerkezet mérete számít, mivel a fázis valószínűségi eloszlása fordítottan arányos az atomok számának négyzetgyökével. A közvetlen módszer a leghasznosabb technika a fázisproblémák megoldására.