Fototoxicitás vizsgálati módszerei és állati alternatív módszerei

Elkerülhetetlen a vegyi anyagok fénybiztonságának biztosítása, ha fennáll az emberi expozíció esélye, amint azt a gyógyszerek (20) vagy a kozmetikumok (21) jól példázzák. Egy vegyi anyag fototoxicitási potenciáljának értékelésére különböző vizsgálati módszereket vezettek be, amelyek az in silico(22), in chemico(23), in vitro és in vivo vizsgálatoktól kezdve terjednek. Kifejlesztettek és rutinszerűen alkalmaznak in chemico vizsgálatokat, mint például ROS-termelés (24), in vitro vizsgálatokat, amelyek magukban foglalják a 3T3 NRU vizsgálatot és a 3D epidermisz modellt, valamint in vivo vizsgálatokat tengerimalac, egér vagy pigmentált patkányok alkalmazásával (25).

Fényforrás a fototoxicitáshoz. A fototoxicitás fényforrása rendkívül fontos, mivel a vizsgált vegyi anyag által elnyelt hullámhossznak (abszorpciós spektrum) és a fény (ésszerű expozíciós idő alatt elérhető) dózisának elegendőnek kell lennie a fototoxicitás kiváltásához (26). A természetes napfényt szimuláló napszimulátorokat tekintik ideális mesterséges fényforrásnak (5. ábra).

A szűrt napszimulátor besugárzási teljesítményeloszlásának közel kell lennie a kültéri napfényhez. A napszimulátorok xenon ívekkel vagy (adalékolt) higany-fém-halogenid ívekkel vannak felszerelve. Ezeket is megfelelően szűrni kell, hogy csillapítsák az erősen citotoxikus UVB hullámhosszakat. Az e szűrők alatt rögzített spektrum nem térhet el a szabványosított kültéri napfénytől (specifikáció: FDA CFR Part 201.327, ISO 24444:2010(e), CIE-85-1989).

Az intenzitás és a hullámhossz ellenőrzésére azonban más UVA fényforrás, például UVA-lámpa is használható megfelelő UV-doziméterrel. A fény intenzitása (besugárzási intenzitás) a forrásoktól függően változik, és azt minden egyes fototoxicitási vizsgálat előtt rendszeresen ellenőrizni kell egy megfelelő szélessávú UV-mérővel. Az UV-mérőt minden mérés előtt kalibrálni kell. Ennek megfelelően a besugárzási idő a fényforrás intenzitásától függ (pl. 1,7 mW/cm2 fényforrás esetén 50 perc expozíciós idő szükséges 5 J/cm2 eléréséhez). A besugárzási idő a vizsgálati módszerektől függően is változik. Az 5 J/cm2 dózist (az UVA-tartományban mérve) nem citotoxikusnak, de kellően erősnek határozták meg ahhoz, hogy a 3T3 neutrális vörös felvételi tesztben a vegyi anyagok gerjesztésével fototoxikus reakciókat váltson ki.

3T3 Semleges vörös felvételének vizsgálata. A 3T3 NRU-tesztet az OECD hivatalosan jóváhagyta és 2004. április 13-án OECD TG432 néven jóváhagyta (3). Ez a vizsgálat a fotocitotoxicitást értékeli a sejtek életképességének relatív csökkenésének meghatározásával, miután a vizsgált cikket UV/VIS-sugárzás jelenlétében vagy hiányában expozíciónak tették ki. A 3T3 NRU fototoxicitási vizsgálat elvégzésére olyan vegyi anyagok esetében kerül sor, amelyek megfelelő oldószerben oldva az UV/VIS tartományban abszorpciós spektrumot mutatnak (17). Azt javasolták, hogy ha a moláris extinkciós/abszorpciós együttható kisebb, mint 10 liter x mol-1 x cm-1, akkor a vegyi anyag valószínűleg nem fotoreaktív (pl. 1 cm hosszú fényútvonalú UV küvettában a 0,05 M oldat OD-jének 0,5-nél kisebbnek kell lennie ahhoz, hogy az “abszorbancia = extinkciós együttható x fényút hossza x koncentráció” egyenlet alapján nem tekinthető fotoreaktívnak) (26). A 3T3 NRU teszt nagy érzékenységű, de alacsony specifikus előrejelző képességgel rendelkezik (93%-os érzékenység és 84%-os specificitás). A 3T3 NRU-tesztnek számos korlátja van. Nem képes megjósolni a foto(cito)toxicitáson kívüli olyan káros hatásokat, amelyek egy vegyi anyag és a fény együttes hatásából eredhetnek, mint például a fotogenotoxicitás, fotoallergia (fényérzékenység) vagy fotokarcinogenitás. A 3T3 NRU-tesztet csak a veszélyek azonosítására használják, míg a fototoxikus hatásosság értékelésére való hasznossága nem indokolt.Különösen, ez a vizsgálati rendszer nem rendelkezik metabolikus aktivitással, amely kritikus fontosságú a szisztémásan exponált vegyi anyagok megnyilvánulásában. Ezért a metabolikus aktiválást igénylő, szisztémásan exponált vegyi anyagok, mint a monokrotalin, riddelliin és heliotrin (pirrolizidin alkaloidok) (28) esetében in vivo állatkísérletek javasoltak (5,29).

A 3T3 NRU alapvető vizsgálati elve a sejtek életképességének összehasonlítása UV/Vis besugárzás jelenlétében vagy hiányában, amelyet a vitális festékkel, a semleges vörössel határoznak meg, amely egy gyenge kationos festék, amely könnyen áthatol a sejtmembránokon és intracellulárisan felhalmozódik az életképes sejtek lizoszómáiban. Az alapsejtvonal a Balb/c 3T3 sejt, amely egy egér fibroblaszt, amelyet 1968-ban G.T. Todaro fejlesztett ki egérembriókból. A 3T3 jelölés a “3 napos transzfer, beoltás 3 × 105 sejt” 20 cm2 -es tányérban, és ez a sejt viszonylag stabil, könnyen hozzáférhető és könnyen kezelhető (30). A bőr fibroblaszt a fototoxicitás egyik célsejtje, ami szilárd indokot szolgáltat a 3T3 sejtek alkalmazására.

Az eldöntéshez, hogy a vizsgált cikk fototoxikus-e vagy sem a 3T3 NRU vizsgálatban, a koncentráció-választ kell meghatározni besugárzás jelenlétében és annak hiányában. Ki kell számítani a fotoirritációs faktort (PIF) vagy az átlagos fotoeffektust (MPE) (31). A PIF a nem besugárzott és a besugárzott IC50 (a sejtek életképességét 50%-kal csökkentő koncentráció) aránya, amint azt a 7. ábra mutatja.

A fotocitotoxicitás előrejelzési modellje a PIF (fotoirritációs tényező) segítségével.

Ha az IC50 nem kapható, az MPE-t a következő egyenlet szerint számítják ki

PIF < 2 vagy egy MPE < 0,1 előrejelzést ad: “nincs fototoxicitás”. A PIF > 2 és < 5 vagy az MPE > 0,1 és < 0,15 előrejelzi: PIF > 5 vagy MPE > 0,15 pedig: “valószínűsíthető fototoxicitás”: “fototoxicitás” (8. ábra).

Fotóhatás számítása: A fotóhatást (PEC) egy tetszőleges C koncentrációnál a válaszhatás (REC) és a dózishatás (DEC) szorzataként határozzuk meg, azaz PEC = REC × DEC. A definíciót a (31)-ből átvett módon szemléltetjük. A fényhatás kiszámítása 0,4 koncentrációnál a szövegben megadott egyenletek szerint a következőket adja: RE0,4 = (66% – 11%)/100% = 0,55, DE0,4 = (0,4/0,16 – 1)/(0,4/0,16 + 1) = 0,43, és PE0,4 = 0,24 fényhatás. Az átlagos fotoeffektust a különböző koncentrációjú fotoeffektusok értékeinek átlagolásával kapjuk (31).

Erythrocita hemolízis teszt. A sejtmembránok sebezhetőek a fotokémiailag generált ROS-okkal és gyökökkel szemben. Az eritrociták UVA-indukált károsodását és az ebből eredő hemolízist (fotohemolízis) a vizsgálati cikkek fototoxikus potenciáljának értékelésére használják fel (32). A juh vörösvértesteket (SRBC) vegyszerekkel inkubálják és 20 J/cm2 UVA sugárzással besugározzák. A besugárzást követően az SRBC-ket sötétben inkubálták 2 órán át szobahőmérsékleten, majd további 1 órán át 37℃-on, majd a hemolízist Drabkin-reagenssel és az UV-abszorbancia mérésével 540 nm-en mérték. A fototoxicitás mértékét a hemoglobin SRBC-ből történő felszabadulásával, azaz a fotohemolitikus aktivitással értékeltük a (33) egyenlet szerint.

• ADE: a kitett gyógyszeroldat optikai sűrűsége eritrocitákkal

• AD: a kitett gyógyszeroldat optikai sűrűsége eritrociták nélkül

• C: 100%-os hemolitikus kontrolloldat optikai sűrűsége

A fototoxikus szerek, mint a ciprofloxacin, a norfloxacin vagy az enoxacin 100 μg/ml-nél jelentősen növelik a fotohemolitikus aktivitást 20% felett. E teszt érzékenysége, specificitása és pontossága 67%, 73%, illetve 73% volt 24 vegyi anyag (8 illatanyag, 5 UV-abszorber, 4 gyógyszer, 4 antimikrobiális szer és 3 színezék) esetében az in vivo tengerimalac teszthez képest (34). Az alacsony érzékenység problémás lehet, és teljesítménye jóval gyengébb, mint a 3T3 NRU teszté, ami magyarázhatja a teszt használatának csökkenését az utóbbi időben.

In vitro humán 3D epidermisz modell. Az in vitro sejtalapú módszerek korlátainak leküzdése érdekében vizsgálják a 3D rekonstruált epidermisz modell alkalmazását a fototoxicitási vizsgálatokban (35,36). A vizsgálati elv alapvetően hasonló a 3T3 NRU vizsgálathoz, nevezetesen a szöveti életképesség különbségének értékelése UV/VIS besugárzás jelenlétében és hiányában. Hasonló, PIF-et és MPE-t alkalmazó előrejelzési modell használható (37). A 3D epidermisz modellben azonban vízben nem oldódó anyagok is vizsgálhatók, és a primer keratinociták bizonyos mértékű metabolikus kapacitása megmarad az epidermiszrétegben, ami alkalmazható a metabolikus aktiválást igénylő toxikus anyagokra (38). Ezenkívül lehetséges a citokintermelés mérése, mint például az IL-1β (Interleukin-1β) (39), a comet assay (40) és a szövettani vizsgálat, amelyek figyelembe vehetők a fotoallergén és fotokarcinogén hatás további értékelésében.

In vivo módszerek tengerimalac, egér vagy pigmentált patkányok alkalmazásával. Az emberi fototoxicitás valós forgatókönyvének szimulálására olyan laboratóriumi állatokat alkalmaznak, mint az egerek és a tengerimalacok. Az állatokat helyileg vagy szisztémásan exponálják a vegyi anyagoknak, és megfelelő dózisú UVA sugárzással (általában 10 J/cm2 a tengerimalac-vizsgálatnál, 20 J/cm2 az egér-vizsgálatnál (41)) kezelik. A 0-tól 4-ig terjedő erythema és ödéma pontszámát összeadjuk, és a 72 órás megfigyelés során kapott maximális pontszámot állatonként átlagoljuk, így kapjuk meg az irritációs indexet. A fototoxicitási indexet az “UVA-besugárzott hely irritációs indexe – nem besugárzott hely irritációs indexe” egyenlet alapján kapjuk (42). A 0,6 feletti fototoxicitási index a fototoxicitás lehetőségét jelzi. Alternatívaként a fülvastagság is mérhető az ödéma becslésére egérkísérletekben. Ezek az in vivo vizsgálatok jól tükrözik az emberi fototoxicitás patofiziológiai folyamatát, de az állatok feláldozása, a vizsgálatok elvégzéséhez szükséges költségek és idő sok problémát vet fel, különösen az állatjólét és etika széles körű tudatosításának korában. A nem állatokon alapuló fototoxicitási vizsgálatok egyre népszerűbbek napjainkban, hogy leküzdjék ezeket a problémákat (43).

In chemico módszerek a fototoxicitás értékelésére. A sejtmentes kémcsöves módszereket, nevezetesen az in chemico módszereket a fototoxicitás értékelésére vizsgálták. A vizsgálati cikk fényelnyelésére és fotostabilitására vonatkozó információkat elemezték a fototoxicitás előrejelzésére (44). A reaktív oxigénfajok fotógerjesztés és az azt követő fotoreakció során történő keletkezését alkalmazva egy vegyi anyag fototoxikus potenciálja in chemico értékelhető (12). A szingulett oxigént a p-nitrozodimetilianilin (RNO) fehérítésével detektálják, míg a nitrokék-tetrazolium tesztet (NBT-formazán reakció) a peroxid-termelés meghatározására alkalmazzák az alábbi ábrán látható módon (24),

• Singlet oxigén + imidazol

• → → oxidált imidazol

• + RNO

• → RNO fehérítés + termékek

A RNO keletkezésének vizsgálata 90%-os és 76-os érzékenységet és specificitást mutatott.9%-ot a kozmetikai termékek esetében, valamint 100%-ot és 75%-ot a nem kozmetikai vegyi anyagok esetében. A DNS-szálszakító aktivitás egy másik módja a különböző típusú vegyi anyagok, vagy gyógyszerek UV-indukált fototoxicitásának értékelésére a nyitott vagy zárt körkörös DNS számszerűsítésén keresztül. Ez a vizsgálat szintén nem igényel élő sejteket vagy szöveteket, hanem plazmidot. A plazmidot pufferben feloldjuk és összekeverjük a vizsgálati cikkekkel. Miután a keveréket UV-sugárzással besugározták, a mintákat elektroforézisnek vetik alá. A törött DNS mennyiségét fluoreszcens alapú technológiával elemzik. Az UV által indukált fototoxikus vegyület a DNS-szálak felnyílását eredményezi, és ez függ a hatóanyag koncentrációjától és az UV-besugárzás dózisától (33). Ezek a vizsgálatok nem igényelnek élő sejteket vagy szöveteket, amelyek növelhetik a vizsgálati eredmények változékonyságát. Ezeknek a módszereknek azonban vannak korlátai, amelyek közé tartozik a metabolikus aktiváló kapacitás hiánya, a vízben nem oldódó anyagok (olajok, szilárd anyagok, gélek, formulázott termékek) alkalmazhatatlansága, valamint a fotogenotoxicitás, fotoallergia (fényérzékenység) vagy fotokarcinogenitás előrejelzésére való képtelenség. Ez a vizsgálat a veszély azonosítására korlátozódik, nem pedig a fototoxikus hatásosság értékelésére.