Négy Copaifera faj és a kaurenolsav biztonsági profiljának vizsgálata szalmonella/mikroszóma teszttel
Abstract
A Copaifera nemzetség fái Latin-Amerika és Nyugat-Afrika trópusi régióiban őshonosak. A Copaifera sp-t széles körben használják népi gyógyszerként, és különböző etnofarmakológiai javallatokkal rendelkezik, többek között gonorrhea, hörghurut, asztma, bőrfekélyek, fekélyek, torokfájás, méhgyulladás, általános gyulladások, rák és leishmaniosisok. A kaurenoesav a Copaiferában természetesen előforduló diterpén, amelyet gyulladáscsökkentőként, fekély, leishmaniasis és rák kezelésére használtak. Szem előtt tartva, hogy az Ames-teszt kiváló eszköz a gyógynövényekből izolált kivonatok, olajok és fitokemikáliák biztonságosságának értékelésére, ebből kiindulva a Copaifera nemzetség négy fajának oleorezinjei (C. oblongifolia; C. langsdorffii) és levélkivonatai (C. lucens; C. multijuga) között értékeljük a mutagén potenciált, valamint az egyik fő vegyületének, a kaurenoinsavnak a mutagén potenciálját. Az eredmények azt mutatták, hogy a Copaifera spp. és a kaurénsav nem indukálta a revertáns telepek számának növekedését, mutagén hatás nélkül a kísérletekben, az Ames-teszttel értékelt valamennyi koncentrációban. A vizsgálatunkban kapott eredmények alátámasztják a kiválasztott Copaifera nemzetség gyógynövényeinek és a kaurénsavnak a biztonságos használatát.
1. Bevezetés
A történelem során különböző kultúrák használták a növényeket gyógyászati célokra. A növények valóban bizonyították, hogy a betegségek széles spektrumának kezelésére szolgáló gyógyszerek forrásai. Napjainkban a növényi alapú rendszerek továbbra is alapvető szerepet játszanak az egészségügyben, és világszerte megnőtt az érdeklődés a fitomedicinális termékek iránt, olyannyira, hogy a növényeket még mindig új gyógyhatású hatóanyagok forrásaként vizsgálják.
A Copaifera nemzetségbe tartozó fák Latin-Amerika és Nyugat-Afrika trópusi régióiban őshonosak. A Copaifera nemzetség a hüvelyesek családjába tartozik, és 72 fajt foglal magában. Több mint 20 Copaifera spp. létezik Brazília területén, ahol “copaibeiras”-nak, “pau d’óleo”-nak vagy “copaíbas”-nak nevezik őket. A Copaifera spp. széles körben használatos a népi gyógyászatban. Különböző etnofarmakológiai javallatokkal rendelkeznek, például gonorrhea, hörghurut, asztma, bőrfekélyek, fekélyek, torokfájás, méhgyulladás, általános gyulladások, rák és leishmaniás betegségek kezelésére.
A tudományos irodalom számos beszámolót tartalmaz a Copaifera fajok farmakológiai tevékenységéről, mint például gyulladáscsökkentő , tumorellenes , antiproliferatív , féreghajtó , antituberkuláris , gastroprotektív , kemopreventív , immunmoduláns és antibakteriális hatásukról.
A kaurenolsav egy diterpén, amely természetes módon előfordul néhány brazil növényben, beleértve a Copaifera oleorezineket. A kaurénsavról számtalan farmakológiai tulajdonságot jelentettek, például gyulladáscsökkentő hatását, fekély kezelésére való felhasználását, valamint parazitaellenes, fájdalomcsillapító és rákellenes potenciálját .
Mivel a természetes vegyületeket hagyományosan használják, gyakran feltételezik, hogy biztonságosak. Számos tanulmány azonban arról számolt be, hogy számos, a hagyományos gyógyászatban alkalmazott növényfaj mutagén, rákkeltő vagy toxikus hatást mutat . Ennek ellenére számos növényt és fitoterápiás terméket továbbra is alkalmaznak anélkül, hogy biztonságosságukról tudományos bizonyítékok lennének.
Az Ames-teszt világszerte ismert arról, hogy képes kiszűrni a különböző anyagok által okozott pontmutációkat. Ez a teszt olyan indikatív Salmonella Typhimurium törzseket használ, amelyek érzékenyek a különböző típusú mutációkat előidéző anyagokra. Az Ames-teszt alapján megállapítható egy vegyület mutagén hatása a S. Typhimurium koncentráció függvényében. Ezt a vizsgálatot világszerte alkalmazzák az új gyógyszerek mutagén potenciáljának kezdeti szűrésére. A mutagén válasz nagy prediktív értékkel bír a karcinogenitásra vonatkozóan . Az évek során a tudományos közösség, a kormányzati szervek és a vállalatok felismerték ennek a tesztnek az értékét .
Figyelembe véve, hogy az Ames-teszt kiváló eszköz a gyógynövényekből izolált kivonatok, olajok és fitokemikáliák biztonságosságának értékelésére, ezt a tesztet használtuk négy Copaifera faj oleorezinjeinek vagy levélkivonatainak és a kaurenoic savnak a mutagén potenciáljának értékelésére.
2. Anyagok és módszerek
2.1. Anyagok és módszerek. Növényi anyag
A növényi anyagot Brazília különböző államaiban gyűjtöttük 2012 augusztusa és 2014 májusa között. A növényi utalványokat vagy Dr. Regina Celia Vianna Martins da Silva azonosította a Brazil Mezőgazdasági Kutatási Vállalat (Embrapa) botanikai laboratóriumában (Belém, Pará állam, Brazília), vagy Dr. Milton Groppo Junior a São Paulo-i Egyetem Biológiai Tanszékén (Ribeirão Preto Campus, São Paulo állam, Brazília), ahol az utalványokat letétbe helyezték. Az 1. táblázat az utalványozott példányokra vonatkozó információkat tartalmazza.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
1 SPFR: Ribeirão Preto Filozófiai, Tudományos és Irodalmi Kar, Biológiai Tanszék, Ribeirão Preto, São Paulo; 2 EMBRAPA: Brazilian Agricultural Research Corporation (Embrapa Eastern Amazon).
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
A C. oblongifolia és a C. langsdorffii oleoresinek kinyeréséhez egy csigával fúrtunk egy körülbelül egy hüvelyk átmérőjű lyukat. A lyukat a fatörzs közepén fúrták, három láb magasan a föld felett. Az oleoresint egy szűrőhöz csatlakoztatott cső segítségével egy borostyánsárga üvegbe engedték le. Az oleoresin összegyűjtése után a lyukat megfelelően lezárták .
A C. lucens és a C. multijuga leveleit 40°C-on 48 órán át levegőn szárították, vagy liofilizálták és turmixgépben porrá zúzták. A kapott port 7:3 arányú etanol/vízben szobahőmérsékleten 48 órán át maceráltuk, majd szűrés után az oldószert 40 °C alatt vákuumban elpárologtattuk. Ezt az eljárást négyszer megismételtük, majd a kivonatokat egyesítettük, vákuumban koncentráltuk és liofilizáltuk, ami átlagosan 20 tömegszázalékos hidroalkoholos nyers levél nyers kivonatot eredményezett.
A kaurénsavat (1. ábra), 99% feletti tisztasággal, a Simão et al. által részletezett módon izoláltuk. A Copaifera fajok oleorezinjeit és leveleit gyűjtötték, és a kutatást a brazil kormány SISBIO (Biodiverzitás Információs és Engedélyezési Rendszer #35143-1) és CGEN (Genetikai Örökségkezelő Tanács #010225/2014-5) engedélyezése után fejlesztették ki.
2.2. Ames-teszt
A Copaifera spp. mutagenitásának vizsgálatára az Ames-tesztet használták. A Maron és Ames által kifejlesztett preinkubációs módszertant , exogén aktiválással és anélkül (S9), alkalmazták különböző Salmonella Typhimurium törzsek (TA98, TA100, TA97a és TA102) elemzésére, hogy megpróbálják azonosítani a génmutációkat okozó szereket. A Dr. B.N. Ames (Berkeley, CA, USA) által rendelkezésre bocsátott tesztelő törzseket fagyasztott tenyészetekből 12-14 órán keresztül, egy éjszakán át, Oxoid Nutrient Broth Number 2-ben növesztettük.
A mutagén aktivitás vizsgálatához 0,1 mL baktériumtenyészethez 0,5 mL 0,2 M foszfátpufferben vagy 0,5 mL 4%-os S9 keverékben 0,5 mL 0,2 M foszfátpufferben vagy 0,5 mL 4%-os S9 keverékben különböző koncentrációjú oleoresineket, kivonatokat vagy DMSO-ban oldott kaurénsavat adtunk és 37°C-on 20-30 percig inkubáltuk. A koncentrációk a C. lucens (kivonat) esetében 62,5 és 500 μg/lemez, a C. multijuga (kivonat) esetében 120 és 1000 μg/lemez, a C. oblongifolia (oleoresin) esetében 125 és 1000 μg/lemez, a C. langsdorffii (oleoresin) esetében 500 és 4000 μg/lemez, a kaurénsav esetében pedig 25 és 200 μg/lemez között voltak. Ezeket a koncentrációkat egy előzetes toxicitási vizsgálat alapján választották ki. Minden további vizsgálatban a vizsgált dózistartomány felső határa vagy a legmagasabb nem toxikus dózis, vagy az előzetes vizsgálatban meghatározott legalacsonyabb toxikus dózis volt. A toxicitást vagy a hisztidin-revertánsok (His+) számának csökkenéseként, vagy az auxotróf háttérgyep elvékonyodásaként mutatták ki.
A poliklórozott bifenilek Aroclor 1254 keverékével (500 mg/kg) kezelt Sprague Dawley patkányok májából készített metabolikus aktiváló keveréket (S9 frakció) a Molecular Toxicology Inc. (Boone, NC, USA) vásároltuk, és minden egyes vizsgálat előtt frissen készítettük el. A metabolikus aktiváló rendszer 4% S9 frakcióból, 1% magnézium-klorid 0,4 M, 1% kálium-klorid 1,65 M, 0,5% D-glükóz-6-foszfát-dinátrium 1 M és 4% nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát nátriumsóból (NADP) 0,4 M állt.1 M 50% 0,2 M foszfátpufferben és 39,5% steril desztillált vízben.
Az inkubálás után 2 ml felső agart adtunk hozzá, és a keveréket egy minimális agart tartalmazó lemezre öntöttük. A lemezeket 37°C-on inkubáltuk 48 órán át, majd a His+ revertáns kolóniákat kézzel megszámoltuk.
Az eredményeket a Salanal 1.0 statisztikai szoftvercsomaggal (U.S. Environmental Protection Agency, Monitoring Systems Laboratory, Las Vegas, NV, a Research Triangle Institute, RTP, NC, USA) elemeztük; a Bernstein et al. modelljét alkalmaztuk. Az adatokat (revertánsok/lemez) varianciaanalízissel (ANOVA), majd lineáris regresszióval értékelték. A mutagén indexet (MI) is kiszámítottuk minden egyes vizsgált koncentrációra, és ez megfelelt a revertánsok átlagos száma tesztlemezenként osztva a revertánsok átlagos számával az oldószeres kontrolllemezen. Egy mintát akkor tekintettünk mutagénnek, ha dózis-válasz összefüggést észleltünk, és az MI nagyobb volt kettőnél (MI > 2) egy vagy több koncentrációnál .
A következő standard mutagéneket használtuk pozitív kontrollként az S9 keverék nélküli kísérletekben: 4-nitro-O-feniléndiamin (10 μg/lemez) a TA98 és TA97a esetében, nátrium-azid (1,25 μg/lemez) a TA100 esetében és mitomicin C (0,5 μg/lemez) a TA102 esetében. Az S9 aktiválással végzett kísérletekben a TA98, TA97a és TA100 esetében 2-antramint (1,25 μg/lemez), a TA102 esetében pedig 2-aminofluorént (10 μg/lemez) használtunk pozitív kontrollként. DMSO szolgált oldószer-kontrollként (100 μL/lemez), a negatív kontroll pedig az egyes törzsek spontán reverziójának arányának felel meg.
3. Eredmények
A 2. táblázat a revertánsok átlagos számát/lemez (M), a standard eltérést (SD) és a mutagén indexet (MI) mutatja, amelyet az S. Typhimurium TA98, TA100, TA102 és TA97a törzsek esetében a metabolikus aktiválás jelenlétében (+S9) vagy hiányában (-S9), miután a mintát a célzott oleorezinnel, kivonattal vagy vegyülettel kezelték.
|
(a)
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
(b)
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
(c)
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
(d)
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
(e)
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
< 0.05 (ANOVA); < 0,01 (ANOVA); M ± SD = átlag és standard eltérés; Negatív kontroll: spontán reverzió mértéke; Oldószerkontroll: dimetil-szulfoxid (DMSO, 100 μL/lemez); Pozitív kontroll (C+); a 4-nitro-o-feniléndiamin (10.0 μg/lemez, TA98 és TA97a); b nátrium-azid (1,25 μg/lemez, TA100); c mitomicin (0,5 μg/lemez, TA102), S9 hiányában; és d 2-antramin (1,25 μg/lemez, TA98, TA100 és TA97a); e 2-amino-fluorén (10,0 μg/lemez, TA102), S9 jelenlétében. A zárójelben szereplő értékek (MI) ≥2 mutagenitást jeleznek.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sem a C. lucens és C. multijuga levélkivonatok, sem a C. langsdorffii és C. oblongifolia oleorezinek nem okoztak genetikai mutációkat, amint azt az Ames-teszt bizonyította. A kaurénsav sem növelte a revertáns telepek számát, így nem gyakorolt mutagén hatást egyik vizsgált koncentrációban sem, illetve egyik vizsgált törzsre sem. Az oldószeres kontroll (DMSO) nem különbözött jelentősen a revertánsok számában a negatív kontrolltól.
4. Megbeszélés
A növények által kifejtett mutagén hatások az emberben nem könnyen észlelhetők, és hosszú távon káros következmények, például rákos megbetegedések jelentkezhetnek. Ezáltal a tudományos irodalom kiemelte a gyógynövények mutagén hatásuk szűrésének fontosságát . Ebben az értelemben itt a Copaifera spp. és a kaurénsav mutagén potenciálját vizsgáltuk az Ames-teszt segítségével. Akyıl és Konuk hangsúlyozta, hogy a genotoxikus ágensek kimutatása gyakran támaszkodik a baktériumok mint tesztorganizmusok használatára. Ily módon az Ames-teszt (vagy szalmonella/mikroszóma teszt) az a módszer, amelyet a leggyakrabban használnak a genotoxikus ágensek mutagén hatásainak kimutatására .
Az Ames-teszt teljesítménye a különböző törzsek felhasználásával nagy jelentőséggel bír, figyelembe véve az egyes törzsek sajátosságait a teszthez képest. Így a TA100 törzsben a hisG46 marker egy leucin (GAG/CTC) prolinnal (GGG/CCC) történő helyettesítéséből származik. Ezt a mutációt olyan mutagének állítják vissza a vad típusú állapotba, amelyek elsősorban az egyik GC-párnál okoznak bázispáros szubsztitúciós mutációkat. A TA98 törzs által hordozott hisD3052 mutáció egy -1 frameshift mutáció, amely egy közeli ismétlődő -C-G-C-C-G-C-C-G-G-C-G- szekvencia olvasási keretét érinti. A hisD3052 mutáció visszafordulását a vad típusú állapotba különböző frameshift mutagének indukálják, mint például a 2-nitrofluorén és az amin-karcinogének különböző aromás nitrozoszármazékai. A TA97a törzsben a hisD6610 mutáció szintén egy +1 frameshift mutációt (citozin) hordoz, ami egy 6 citozinból álló futást eredményez (-C-C-C-C-C-C-C-C-). Ez a törzs feltehetően érzékenyebb a TA98 törzset visszafordító mutagének némelyikével szemben. Kifejlesztették a TA102 törzset, amely AT bázispárokat tartalmaz a hisG428 mutáns helyen. A mutációt a PAQ1 multikopiás plazmidon hordozzák. A plazmid tetraciklin-rezisztenciát kölcsönöz, amely alkalmas marker a plazmid jelenlétének kimutatására. A hisG428 mutáció egy okkersárga mutáció, TAA, a hisG génben, amely mind a hat lehetséges bázispár-változással visszafordítható; mind átmenetekkel, mind transzverziókkal. Ez a mutáció oxidatív károsodást okozó mutagénekkel is visszafordítható, a keresztkötő anyagok kimutatása mellett .
Ezeken kívül egy biológiailag aktív vegyi anyag biotranszformálódhat egy inaktív metabolitba. Hasonlóképpen, egy inaktív vegyi anyag biotranszformálható aktív metabolizittá . Ezért fontos az S9 frakció használata az Ames-tesztben: lehetővé teszi az elemzések elvégzését metabolizmus jelenlétében, ezáltal megbízhatóbb eredményeket biztosít.
A biztonságosság tekintetében megállapításaink szerint sem a kaurénsav, sem a vizsgált növények (kivonatok és oleorezinek) nem fejtettek ki mutagén hatást a Salmonella Typhimurium különböző törzseiben, függetlenül az S9 aktiválástól.
A Copaifera nemzetségről szóló legtöbb tanulmány a fa törzséből eltávolított oleorezinekről számol be. A levélkivonatok tanulmányozása azonban azért is fontos, mert ígéretes bioaktív molekulákat tartalmaznak. Valójában a betegségek gyógyításának keresése levélinfúzióval lehetett a természetes termékek felhasználásának egyik első módja, és ezt a gyakorlatot napjainkban is alkalmazzák.
Más országokban számos Copaifera spp. népszerű gyógynövényként használatos, mivel ezek a fajok számos farmakológiai tulajdonsággal rendelkeznek. A kaurénsavhoz hasonlóan számos biológiai hatásról is beszámoltak .
A mi tanulmányunk az első, amely a C. lucens és a C. oblongifolia fajok biztonságosságát vizsgálta, valamint a C. langsdorffii oleoresinben való alkalmazását a mutagenitás vizsgálatára. A C. multijuga (oleoresin/kivonat) DNS-re gyakorolt hatásaival korábbi tanulmányok is foglalkoztak, azonban a mi tanulmányunkhoz képest eltérő technikákat alkalmazva, amelyek az Ames-tesztet használták. Így eredményeink alátámasztják más szerzők által közzétett adatokat, akik más Copaifera fajokat és azok kémiai összetevőit vizsgálták, vagy más kísérleti modelleket használtak, és kimutatták, hogy nem károsítják a DNS-t.
Ezzel a C. multijuga és kémiai markerét, a diterpén kopálsavat Alves és munkatársai in vitro vizsgálathoz mikronukleusz-teszttel (V79 sejt) és Ames-teszttel, valamint in vivo vizsgálathoz mikronukleusz- és comet-teszttel (svájci egerek) értékelték. A kapott adatok azt mutatták, hogy az alkalmazott kísérleti körülmények között egyikük sem fejtett ki genotoxikus/mutagén hatást. A mi eredményeinkkel összehasonlítva ezek az adatok azt mutatják, hogy a C. multijuga esetében mind a mi vizsgálatunkban vizsgált kivonat, mind az Alves és munkatársai által vizsgált oleorezin nem befolyásolja a revertáns telepek számát a negatív kontrollhoz képest az Ames-tesztben; ugyanez vonatkozik a kopálsavra és a kaurenoesavra is. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a mutagenitás hiányzik, függetlenül a metabolikus aktiválástól.
Egy közelmúltbeli tanulmányban Furtado és munkatársai értékelték a C. multijuga genotoxikus potenciálját, és az eredmények a DNS-károsodás hiányát mutatták, tekintettel arra, hogy mind az oleoresinnel, mind a C. multijuga levélkivonattal történő kezelés nem növeli jelentősen a mikronukleuszok gyakoriságát in vitro (V79 sejt) és in vivo (svájci egerek). A szerzők emellett a nemzetség más fajainak – C. duckei, C. reticulata, C. paupera és C. pubiflora – kivonatait és oleorezinjeit is értékelték, és a C. multijuga esetében talált eredményekhez hasonlóan valamennyi vizsgált faj esetében a genotoxicitás hiányáról számoltak be.
Az Alves et al. és Batista et al. vizsgálatai során kapott eredmények azt mutatták, hogy a C. langsdorffii kivonat nem növelte jelentősen a mikronukleuszok gyakoriságát (svájci egerek) a perifériás vérben, illetve a csontvelőben. Egy másik vizsgálatban a Wistar patkányokon végzett comet-teszt nem mutatott szignifikáns különbséget a kizárólag C. langsdorffii kivonattal kezelt állatok és a negatív kontrollcsoport között. Ezek az adatok azt mutatják, hogy a kivonat nem mutat genotoxicitást.
Újabban a Wistar patkányokon végzett in vivo mikronukleusz teszt és comet assay azt mutatta, hogy a Copaifera malmei kivonat nem genotoxikus és antimutagén hatással rendelkezik. Továbbá, a szubkrónikus toxicitási teszt nem mutatott toxikológiailag releváns változásokat a viselkedési, biokémiai és hematológiai elemzések alapján 30 napig. Ezek az eredmények rámutattak a Copaifera malmei kivonat nagy biztonsági tartalékára a terápiás felhasználás szempontjából. A toxicitási és genotoxicitási meghatározások azt bizonyították, hogy a Copaiba olaj használata is biztonságos: a szövettani értékelés nem mutatott ki elváltozásokat a Copaiba olajjal kezelt állatokban, és a mutagenitás vizsgálata (mikronukleusz teszt; 2000 mg/ttkg) nem mutatott genotoxikus hatást .
Leandro és munkatársai az Ames-teszt segítségével kimutatták, hogy a C. trapezifolia kivonat nem mutagén az itt vizsgált Salmonella Typhimurium törzsekkel szemben, függetlenül a metabolikus aktiválástól.
A különböző Copaifera fajok kémiai összetételével kapcsolatban az oleorezinek UPLC-MS/MS és CG/MS elemzései savas diterpéneket és főbb illékony szeszkviterpéneket azonosítottak, míg a levelekben magas fenolos vegyületek, köztük flavonoid heterozidok és gallokininsav-származékok tartalmát igazolták . Az oleorezin alkotórészei közül messze a diterpének a fő komponensek, köztük az ent-agaténsav, az ent-kopálsav és az ent-kaurénsav, majd a szeszkviterpének, mint a β-biszabolén, az α-humulén és a transz-β-karyofilén . A Copaifera fajok levelének hidroalkoholos kivonatai főként kvercetint, afzelint és kininsavakat tartalmaznak .
Az Almeida et al. , a Copaiba oleoresin (kereskedelmi termék) és frakciói, amelyek szeszkviterpéneket, diterpén-karbonsav metil-észtereket és magas β-karyophyllen szintet tartalmaznak, nem genotoxikusak, amint azt az in vivo comet assay vagy a mikronukleusz teszt bizonyítja. A β-karyophilén, az oleorezinek és az illófrakciók fő alkotóeleme, emberi limfocita-kultúrákban nem fejti ki citotoxikus vagy genotoxikus hatását, és véd az etil-metán-szulfonát által kiváltott DNS-károsodással szemben. Kilenc szeszkviterpén, köztük a transz-karyofilén értékelése az Ames-teszttel azt mutatta, hogy egyik vegyület sem mutagén .
Egy nemrégiben végzett vizsgálatban a gyomorrák és a normál gyomornyálkahártya sejtvonalak kaurénsavval történő kezelése azt mutatta, hogy a sav koncentrációja erősen korrelál a DNS-károsodási indexszel és a mikronukleusz gyakorisággal, amint azt comet assay-vel, illetve mikronukleusz teszttel határozták meg . Másrészt Cavalcanti és munkatársai arról számoltak be, hogy a C. langsdorffii-ból kivont bioaktív diterpenoid, a kaurénsav alacsony koncentrációja nem okoz DNS-károsodást és nem változtatja meg a mikronukleuszok gyakoriságát a V79 sejtekben sem. Szignifikánsan fokozott DNS-károsodás csak magasabb kaurénsav-koncentrációknak (30 vagy 60 μg/ml) való sejt-expozíció után vált nyilvánvalóvá.
Itt a kaurénsav toxicitását határoztuk meg az egyes vizsgált Salmonella Typhimurium törzsekre a toxicitási határértéktől kezdődő savkoncentrációk alkalmazásával. A magasabb kaurénsav-koncentrációk megakadályozzák a baktériumok növekedését, ami lehetővé tette számunkra, hogy felmérjük e vegyület mutagén potenciálját. Eredményeink alapján az itt vizsgált oleorezinek még a legmagasabb vizsgált koncentrációkban sem mutagén hatásúak.
A szakirodalom szerint a különböző organizmusok vagy különböző tesztrendszerek használata eltérő eredményeket adhat . Ennek oka, hogy a genotoxicitási és mutagenitási vizsgálati rendszerek két csoportra oszthatók. A citogenetikai módszerek eukariótákat elemeznek, és a génmutációtól a kromoszómakárosodásig és az aneuploidiaig terjedő információkat adnak. Ezzel szemben a bakteriális módszerek prokariótákat elemeznek, és információt nyújtanak a génmutációról és az anyag által okozott elsődleges DNS-károsodásról .
Így a humán biomonitoringban a kromoszóma szintű DNS-károsodás kimutatására olyan teszteket alkalmaztak, mint a testvér-kromatid csere, a kromoszóma aberráció és a mikronukleusz, míg az Ames Salmonella/mikroszóma mutagenitás vizsgálatot széles körben alkalmazzák számtalan kémiai anyag és nyers növényi kivonat mutagén hatásának ellenőrzésére .
Ferguson szerint az anyagok emlőssejtek esetében klasztogének lehetnek, ami a mikronukleusz tesztben használt anyagok esetében áll fenn. Azonban ugyanezek az anyagok bakteriális tesztekben, mint például az Ames-teszt, negatívnak bizonyulhatnak. Ezért fontos, hogy a növények vagy kémiai vegyületeik biztonságosságát a genetikai károsodás különböző fajtáinak értékelésére összpontosítva értékeljük. Az Ames-teszt és az in vitro emlőssejtes vizsgálatok összekapcsolása azért ajánlott, mert ezek több lényeges mutagén paramétert (genetikai mutációk, strukturális kromoszómakárosodás és aneuploidia) le tudnak fedni, és lefedik a prokarióta és eukarióta rendszerekben végzett vizsgálatokat is. Emellett a szakirodalom azt is kiemeli, hogy az Ames-teszttel végzett vizsgálatot nem szabad kihagyni, mert a bakteriális génmutációs teszt minden releváns hatásmódot kimutat, amely kifejezetten génmutációkhoz vezet .
A korábbi munkák megfigyelték, hogy a vegyületek kizárólag egy vagy több emlős sejtvonalon lehetnek pozitívak, azaz a pozitív eredmények nem támasztják alá az Ames-teszt vagy az in vivo vizsgálatok eredményeit . Valójában az először az Ames-teszttel kapott eredményeket később az állatokon végzett vizsgálatokban reprodukálták ; ezért a mutagenitás hiánya az Ames-tesztben lehetővé tette új, kevesebb mellékhatással rendelkező gyógyszerek előállítását . Ezek az adatok kiemelik a miénkhez hasonló, a növényi mutagenitás hiányát és annak fő összetevőit az Ames-teszt segítségével bizonyító vizsgálatok fontosságát.
5. Következtetések
Eredményeink összességében alátámasztják a Copaifera nemzetséghez tartozó kiválasztott gyógynövények biztonságos használatát. Mindazonáltal az egyes vegyületek mutagén hatásait elfedhetik a kivonatokban vagy oleorezinekben jelen lévő más vegyületek antagonista hatásai . Így eredményeink azt is bizonyítják, hogy mind a kaurénsav, mind az értékelt gyógynövények potenciálisan biztonságosnak tekinthetők a terápiás felhasználás szempontjából.
Adatok elérhetősége
A tanulmány eredményeinek alátámasztására használt adatok a cikkben szerepelnek.
Tájékoztatás
Carlos Henrique Gomes Martins, Flávia Aparecida Resende és Jaqueline Lopes Damasceno teljes hozzáféréssel rendelkeztek a tanulmányban szereplő összes adathoz, és felelősséget vállalnak az adatok integritásáért és az adatelemzés pontosságáért.
Érdekütközések
A szerzőknek nincs nyilvánosságra hozandó összeférhetetlensége.
A szerzők hozzájárulása
Yadira Fernández Arnet, Giovanna Capaldi Fortunato, Luiza Girotto, Gabriel Davi Marena, Beatriz Patti Rocha, Flávia Aparecida Resende, Sergio Ricardo Ambrosio, Rodrigo Cássio Sola Veneziani és Jairo Kenupp Bastos jelentősen hozzájárultak a koncepcióhoz és a tervezéshez, az adatok megszerzéséhez, elemzéséhez és értelmezéséhez. Jaqueline Lopes Damasceno, Flávia Aparecida Resende és Carlos Henrique Gomes Martins részt vettek a kézirat megszövegezésében vagy kritikusan átdolgozták azt a fontos szellemi tartalom miatt. Carlos Henrique Gomes Martins és Flávia Aparecida Resende vállalták, hogy a munka minden vonatkozásáért felelősséget vállalnak. Minden szerző elolvasta és jóváhagyta a végleges kéziratot.
Köszönet
A szerzők köszönetet mondanak a CAPES-nek (Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel), a CNPq-nek (National Council for Scientific and Technological Development) és a São Pauló-i Kutatási Alapítványnak (FAPESP, Grants nr. 2011/13630-7 és 2012/25237-0) a pénzügyi támogatásért, valamint a Franca Egyetemnek a kapott támogatásért. Jaqueline Lopes Damasceno a CAPES (Coordination for the Improvement of Higher Level-or Education-Personnel) doktori ösztöndíjban részesült.