Modafinil hatása a viselkedésre és az oxidatív károsodási paraméterekre Wistar patkányok agyában
Abstract
A modafinil (MD) hatását vizsgálták a viselkedésre és a fehérjék és lipidek oxidatív károsodására patkányok agyában. Wistar patkányoknak egyszeri adagban vizet vagy MD-t (75, 150 vagy 300 mg/kg) adtak be fecskendővel. A viselkedési paramétereket a gyógyszer beadása után 1, 2 és 3 órával nyílt terepen értékelték. A tiobarbitursavval reagáló anyagokat (TBARS) és a fehérje-karbonil képződést mértük az agyban. Az MD a legmagasabb dózisban 1 és 3 órával a beadást követően növelte a mozgásszervi aktivitást. Az MD 300 mg/kg dózisban történő beadása 1 órával a beadást követően növelte a nyílt terep központjának látogatását; 3 órával a beadást követően azonban az MD minden beadott dózisa növelte a nyílt terep központjának látogatását. A 300 mg/kg MD növelte a lipidkárosodást az amygdalában, a hippokampuszban és a striatumban. Emellett az MD növelte a fehérjekárosodást a prefrontális kéregben, az amygdalában és a hippokampuszban; ez a hatás azonban a beadott dózistól függően változik. Ezzel szemben az MD 75 és 300 mg/kg adagolása csökkentette a fehérjekárosodást a striatumban. Ez a vizsgálat azt mutatta, hogy az MD beadása viselkedésbeli változásokat idéz elő, ami az alkalmazott dózistól függött. Emellett úgy tűnt, hogy az MD oxidatív károsodási paraméterekre gyakorolt hatása specifikus agyi régióban és dózisokban érvényesül.
1. Bevezetés
A modafinil (MD) egy nem amfetaminerg pszichoaktív gyógyszer, amelyet gyakran írnak fel alvás, például narkolepszia, obstruktív alvási apnoe szindróma és műszakos alvászavar kezelésére . Emellett a szakirodalomban jól leírták, hogy az MD számos kognitív területen fokozza a funkciókat, valamint a munkamemóriát és az epizodikus memóriát . Az MD-nek a memóriára gyakorolt ilyen hatásait pszichiátriai betegeknél is leírták, ami arra utal, hogy ez a gyógyszer kiváló jelölt hatóanyag a pszichiátriai rendellenességek kognitív diszfunkcióinak kezelésére . Emellett klinikai kutatások kimutatták, hogy az MD javítja a súlyos depresszióban, bipoláris zavarban, skizofréniában és figyelemhiányos/hiperaktivitási zavarban (ADHD) szenvedő betegek tüneteit .
Az MD hatásmechanizmusa kevéssé ismert; az azonban ismert, hogy ez a gyógyszer fontos hatást gyakorol az agy katekolamin, szerotonin, glutamát, gamma-amino-vajsav, orexin és hisztamin rendszerére . Emellett a vizsgálatok azt mutatják, hogy az MD gátolja a dopamin transzportert, növelve a dopaminerg neurotranszmissziót az éberségi áramkörökben . Az olyan pszichostimulánsok, mint az amfetamin, amelyek szintén különböző neurotranszmitter-rendszerekre hatnak, kimutatták, hogy kifejezett hatást gyakorolnak a viselkedésre, beleértve a félelem, a szorongás és a hiperaktivitás kialakulását . Az MD azonban kevésbé kapcsolódik olyan mellékhatásokhoz, mint a hiperaktivitás, szorongás, idegesség vagy rebound hatások, mint a hagyományos stimulánsok .
Számos vizsgálatok szerint a pszichostimulánsok beadása oxidatív stresszhez vezethet a patkányok agyában. Az agy különösen érzékeny a reaktív oxigénfajok (ROS) termelésére, mivel a teljes test oxigénjének 20%-át metabolizálja, és korlátozott mennyiségű antioxidáns kapacitással rendelkezik . A pszichostimulánsok, például metilfenidát, m-amfetamin és d-amfetamin krónikus adagolása patkányokban fokozott szuperoxid-termelést, a fehérjék, lipidek és DNS oxidatív károsodását, valamint az antioxidáns enzimek és a mitokondriális légzési lánc komplexek változását idézte elő .
Ezért a jelen vizsgálat célja az volt, hogy értékeljük az MD hatását a viselkedésre és az oxidatív stressz paraméterekre a patkányok hippokampuszában, prefrontális kéregben, amygdalában és striatumában.
2. Kísérleti módszerek
2.1. Kísérleti módszerek
2.1. Kísérleti módszerek. Állatok
A kísérleti alanyok felnőtt hím Wistar patkányok voltak (súlyuk 250-350 g), amelyeket tenyésztelepünkről nyertünk. Az állatokat öten egy ketrecben helyeztük el, ahol ad libitum állt rendelkezésünkre táplálék és víz, és 12 órás fény/sötét ciklusban tartottuk őket (a lámpákat reggel 7:00-kor kapcsoltuk be), °C-os hőmérsékleten. Minden kísérleti eljárást az Universidade do Extremo Sul Catarinense helyi etikai bizottságának jóváhagyásával összhangban végeztünk. Minden kísérletet ugyanabban az időpontban végeztünk a nap folyamán, hogy elkerüljük a cirkadián variációkat.
2.2. A kísérleteket a nap folyamán azonos időpontban végeztük. Gyógyszerek és farmakológiai eljárások
A MD (Libbs Farmacêutica Ltda) felfüggesztésre került a jármű-járműben: 1%-os metilcellulózban vízben. Az oldatokat közvetlenül a felhasználás előtt készítettük el, és a kísérleti ülés alatt fénytől védve volt. A szuszpendált oldatot az injekció beadásának teljes időtartama alatt kevertettük. A kontrollcsoport a vivőanyagot kapta.
2.3. Kísérleti elrendezés
A kísérletben felhasznált patkányok száma összesen 40 volt ( csoportonkénti állatok). Az állatok egyszeri adag MD-t (75, 100 vagy 300 mg/ttkg testtömeg-kilogramm) kaptak 1 ml/kg térfogatban, nyelőcsővel beadva. A kontrollcsoport 1 ml/kg térfogatú vivőanyagot kapott. A lokomotoros aktivitást 1, 2 és 3 órával az injekció beadása után mértük, majd a patkányokat közvetlenül a nyílt terepen végzett feladat után lefejezéssel megöltük.
2.4. Lokomotoros aktivitás
A lokomotoros aktivitást a korábban leírtak szerint a nyílt terepen végzett feladat segítségével vizsgáltuk. Ezt a feladatot egy barna rétegelt lemezből készült, 50 cm magas falakkal körülvett 40 × 60 cm-es nyitott mezőben végeztük, a padlót fekete vonalakkal 9 egyenlő négyzetre osztottuk. Az állatokat óvatosan a bal hátsó téglalapra helyezték, és 5 percig szabadon felfedezhették az arénát. A nyílt mezőn végzett teszt során a következő viselkedési paramétereket értékeltük.
Keresztezések (lokomotoros aktivitás/horizontális aktivitás): a patkányok által a teljes tesztidőszak alatt átkelt négyzetek teljes számát számoltuk.
Hátrálás (felfedező aktivitás/vertikális aktivitás): a patkányok teljes felegyenesedett testtartását számoltuk a teljes tesztidőszak alatt.
A nyílt mező közepén tett látogatások száma: a nyílt mező közepén tett látogatások teljes számát számoltuk. A centiméteres középső négyzetet a mező “középső” területeként határoztuk meg.
2.5. Az oxidatív károsodási markerek mérése
A denevéreket a fent leírtak szerint MD-vel vagy vízzel kezelték, majd az utolsó injekció beadása után 3 órával lefejezéssel megölték őket, és agyukat eltávolították és felboncolták a prefrontális kéreg, az amygdala, a hippokampusz és a striatum oxidatív károsodási szintjének értékeléséhez. A TBARS és a fehérje-karbonil képződést a korábban leírtak szerint mértük .
2.6. Tiobarbitursav reaktív anyagok (TBARS)
A ROS-termelés indexeként mértük a TBARS képződését savas hőreakció során, amelyet széles körben elfogadott érzékeny módszer a lipidperoxidáció mérésére, a korábban leírtak szerint . Röviden, a mintákat 1 mL 10%-os triklór-ecetsavval (TCA) és 1 mL 0,67%-os tiobarbitursavval (TBA) kevertük, majd forró vízfürdőben 15 percig melegítettük. A TBARS-t az 535 nm-en mért abszorbancia alapján határoztuk meg. Az eredményeket MDA (malondialdehid) egyenértékben (nmol/mg fehérje) fejeztük ki.
2.7. A fehérje-karbonilok mérése
A fehérjék oxidatív károsodását a karbonilcsoportok dinitrofenilhidrazin (DNPH) reakción alapuló meghatározásával értékeltük a korábban leírtak szerint . Röviden, a fehérjéket 20%-os triklórecetsav hozzáadásával kicsaptuk, majd DNPH-ban újra feloldottuk, és az abszorbanciát 370 nm-en olvastuk le.
2.8. Statisztikai elemzés
Minden elemzést a Statistical Package for Social Sciences 19.0 verziójával (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) végeztünk. Minden adatot átlag ± SEM értékben mutattunk be. A csoportok közötti különbségeket a viselkedéselemzésben az időválaszgörbéhez való hozzáférés érdekében ismételt mérési varianciaelemzéssel ellenőriztük, amelyet Tukey post hoc tesztek követtek. A csoportok közötti különbségek vizsgálatához a biokémiai elemzésben ANOVA-t használtunk, amelyet Tukey post hoc tesztek követtek. Minden kísérletben a < 0,05 értékeket tekintettük statisztikai szignifikanciát jelzőnek.
3. Eredmények
3.1. Eredmények
3. Viselkedéselemzés
A helyváltoztatás (átkelések) elemzésénél (1. ábra a)) az ismételt mérések varianciaanalízise szignifikáns különbségeket mutatott az MD beadása (F(3.35) = 7.91, ) és a viselkedési ismétlések (F(2.7) = 54.82, ) tekintetében. A Tukey-féle post hoc teszttel végzett további elemzés azt mutatta, hogy az MD 300 mg/kg adagban növelte a patkányok spontán lokomócióját a kontrollcsoporthoz képest 1 órával a beadást követően. Ezenkívül a kontrollcsoport, a 75 mg/kg-os MD és a 150 mg/kg-os MD csökkentett számú átkelést mutatott, amikor 3 órával később újra kitették a nyílt mezőnek, ami a környezethez való hozzászokást jelzi. A 300 mg/kg MD-vel kezelt patkányok azonban csökkentett számú átkelést mutattak, amikor 2 és 3 órával később újra kitették őket a nyílt mezőnek. Ez a különbség a 300 mg/kg dózisú MD beadása után 1 órával kiváltott motoros hiperaktivitással magyarázható.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
A felfedezés (hátrálás) elemzésénél (1. ábra (b)) az ismételt méréses varianciaanalízis szignifikáns különbségeket mutatott a viselkedési ismétlések tekintetében (F(2,7) = 32,7, ). A Tukey-féle post hoc teszttel végzett további elemzés azt mutatta, hogy a kontrollcsoport, a 75 mg/kg-os MD és a 150 mg/kg-os MD csökkentett számú hátrahúzódást mutatott, amikor 3 órával később újra kitették őket a nyílt terepen. A 300 mg/kg-os MD csökkentette a hátrálások számát, amikor 2 és 3 órával később újra kitették a nyílt mezőnek.
A nyílt mező közepén tett látogatások elemzésénél (1. ábra (c)) az ismételt mérések varianciaanalízise szignifikáns különbségeket mutatott az MD beadása esetén (F(3,34) = 15,70, ). A Tukey-féle post hoc teszttel végzett további elemzés azt mutatta, hogy az MD 300 mg/kg adagban növelte a nyílt mező középpontjának látogatását a kontrollhoz képest 1 órával a beadás után. Ezenkívül az MD minden beadott dózisban növelte a nyílt mező középpontjának látogatását 3 órával a beadás után.
3.2. Biokémiai elemzés
Amint az a) ábrán látható, a TBARS-szintek szignifikánsan emelkedtek a 300 mg/kg MD-vel kezelt patkányok amygdalájában (F(3) = 4,18, ), hippokampuszában (F(3) = 44,9, ) és striatumában (F(3) = 7,07, ) a kontrollcsoporthoz képest.
(a)
(b)
(a)
(b)
.
Amint a 2. b) ábrán megfigyelhető, az MD beadása után a prefrontális kéregben (F(3) = 29,9, ) 300 mg/kg dózisban, valamint az amygdalában (F(3) = 9,74, ) és a hippokampuszban (F(3) = 17,99, ) 75 mg/kg dózisban a karbonilképződés szignifikáns növekedését észleltük. Ezzel szemben a 75 és 300 mg/kg-os MD kezelés szignifikánsan csökkentette a karbonil generációt a striatumban (F(3) = 21,93, ) a kontroll csoporthoz képest.
4. Megbeszélés
A jelen vizsgálatban megfigyeltük, hogy az MD egyszeri, nagy dózisú (300 mg/kg) injekciója patkányokban hiperlokomóciót vált ki, amely nem marad meg 2 és 3 órával a beadás után. Eredményeink szerint az MD jelentősen növelte a lokomotoros aktivitást és növelte a striatális extracelluláris dopaminszintet rhesus majmokban . Young és munkatársai kimutatták, hogy az MD növelte az aktivitást, a felemelkedést és a mozgásszervi pályák simaságát C57BL/6J és 129/SJ egerekben. Ezek a viselkedés MD által kiváltott változások a megnövekedett szinaptikus dopaminhoz és a dopamin drd1 és drd4 receptorok által közvetített másodlagos hatásokhoz kapcsolódtak. A fenti tanulmánytól eltérően, bár van egy tendencia, nem észleltünk szignifikáns növekedést a felfedező viselkedésben az MD beadása után. Ez az eltérés a módszertan, a fajok és a kezelési idő eltéréseivel magyarázható.
Ezekben megfigyeltük, hogy a kontrollcsoport és az alacsony dózisú MD (75 és 150 mg/kg) csökkentette az átkelések és a hátrahúzódások számát, amikor 3 órával később újra kitettük őket a nyílt terepen, ami a környezethez való hozzászokásra utal. A magas dózisú MD (300 mg/kg) csökkentette az átkelések és a hátrahúzódások számát, amikor 2 és 3 órával később újra kitették őket a nyílt mezőnek. Ez az eltérés azzal a ténnyel magyarázható, hogy az MD (300 mg/kg) beadása után 1 órával jelentősen megnőtt az átkelések száma, és tendenciaszerűen nőtt a hátrálások száma. Az új környezethez való hozzászoktatást a nem asszociatív tanulás egyik legelemibb formájának tartják. Az azonos környezetnek való ismételt kitettség a felfedező viselkedés csökkenését idézi elő, ami a hozzászokás indexének tekinthető .
A jelen vizsgálat érdekes eredménye volt, hogy az MD modulálta a szorongással kapcsolatos viselkedést. A nyílt terepen végzett tesztben az MD-vel kezelt patkányok kevésbé voltak szorongóak, sőt hajlamosabbak voltak az averzív központi területet jobban felfedezni, mint a kontrollok. Az MD 300 mg/kg adagban növelte a nyitott mező középpontjába tett látogatások számát 1 órával a beadás után. Ezen túlmenően az MD minden beadott dózisban növelte a nyitott mező középpontjának felkeresését 3 órával a beadás után. A szakirodalomban a tanulmányok ellentmondásosak az MD szorongásra gyakorolt hatásával kapcsolatban. A preklinikai vizsgálatok vagy nem mutatták ki a modafinil szorongásra gyakorolt hatását, vagy anxiolitikus hatást . Hasonlóképpen, az MD a klinikai vizsgálatokban vagy anxiolitikus hatást mutat, vagy nincs hatása a szorongásra , míg mások anxiogén hatást mutatnak . Ez a tanulmányok közötti különbség az alkalmazott dózisok (100 mg, 200 mg vagy 400 mg) és az adagolási ütemezés (egyszeri kontra krónikus adagolás egy héten vagy több héten keresztül) eltéréseivel magyarázható. Az MD anxiolitikus-szerű hatása a fenyegető ingerekre az amygdala, a szorongásban szerepet játszó agyi régióra gyakorolt hatásával magyarázható. Egy korábbi tanulmány kimutatta, hogy az MD csökkenti az amygdala reaktivitását a félelmetes ingerekre . Ismert, hogy az amygdala gazdag katekolaminerg és szerotoninerg projekciókban , és akkor valószínűleg az MD csökkenti az amygdala reaktivitását az intra-amygdala jelátvitel változásai révén, amelyek a noradrenalin, dopamin, szerotonin vagy GABA rendszerek változásaiból vagy e hatások kombinációjából erednek.
A viselkedési változások kiváltása mellett az irodalomban jól ismert, hogy a pszichostimulánsok oxidatív károsodást okoznak mind az állatmodellekben, mind az emberekben. Eredményeink azt mutatják, hogy az MD növeli a lipidek és a fehérjék oxidatív károsodását a patkányok agyában. Az MD-vel nagy dózisban (300 mg/kg) kezelt patkányok amygdalájában, hippokampuszában és striatumában megnövekedett a TBARS-szint. Ezen túlmenően, az MD beadása után a prefrontális kéregben 300 mg/kg dózisban, valamint az amygdalában és a hippokampuszban 75 mg/kg dózisban a karbonil generáció növekedését figyeltük meg. A vizsgálatok azt mutatják, hogy az MD gátolja a dopamin transzportert, növelve a dopaminerg neurotranszmissziót . Az MD által kiváltott extracelluláris dopamin koncentráció növekedése a dopamin oxidáció toxikus metabolitjának túltermelését idézheti elő , ami a patkányok agyában a fehérjék és lipidek oxidatív károsodásához vezet. A szakirodalomban nincsenek olyan tanulmányok, amelyek az agykárosodást értékelnék az MD beadása után; ezek a vizsgálatok azonban nagyon fontosak, mivel az MD hozzáférhetősége, mint például az éberségfokozó, memóriafokozó és fáradtság elleni gyógyszer, az egészséges emberek számára egyre növekszik .
Az MD-vel való kezelés (75 és 300 mg/kg) csökkentette a karbonil generációt a striatumban a kontrollcsoporthoz képest. Egyes vizsgálatok kimutatták az MD striatális neuroprotektív potenciálját. Korábbi vizsgálatok az 1-metil-1,2,3,6-tetrahidropiridin mérgezett dopaminerg neuronok túlélésének javulását mutatták ki a striatumban MD-kezelés után, a Parkinson-kór állatmodelljében. Raineri és munkatársai kimutatták, hogy az MD adagolása mérsékelte a metamfetamin által kiváltott neurotoxicitást egerek striatumában, ami az MD lehetséges védő szerepére utal ebben az agyi régióban. Kimutatták, hogy az MD javítja a tanulást metamfetaminfüggő betegeknél . Az itt bemutatott eredmények arra utalnak, hogy az MD beadása antioxidáns tulajdonságokat mutathat a striatumban; azonban az MD védő hatása a striatumra még nem ismert. A striatum integrálja a kéregből és a talamuszból származó glutamaterg bemeneteket a középagyból származó dopaminerg afferensekkel . A dopamin jelátvitel kiemelkedő szerepet játszik a striatum függő tanulásában és a közepes tüskés projekciós neuronok szinaptikus plaszticitásában . Rossato és munkatársai kimutatták, hogy a D1 receptor agonista infúziója növelte az agyi eredetű neurotrofikus faktor (BDNF) szintjét és következésképpen a szinaptikus plaszticitást. Így az MD elősegítheti a szinaptikus plaszticitást a dopaminerg rendszer aktiválásával, és következésképpen védi a striatumot az oxidatív károsodástól.
Összefoglalva, képesek vagyunk bizonyítani, hogy (1) az MD nagy dózisban (300 mg/kg) 1 órával a beadás után hiperaktivitást vált ki, amely nem marad meg 2 és 3 órával a beadás után. (2) Az MD szorongásoldó hatást mutatott patkányokban, növelve a nyitott mező közepére történő látogatások számát. (3) Az MD oxidatív károsodást idézett elő a lipidekben és a fehérjékben patkányok agyában; az oxidatív károsodás azonban az elemzett agyi régiótól és a beadott MD dózisától függ. (4) Végül az MD meg tudta védeni a striatumot a fehérjék oxidatív károsodásával szemben. Az eredmények értelmezésekor óvatosan kell eljárni. Először is, az antioxidáns védekezést nem mértük; mivel ez az első tanulmány, amely az MD oxidatív stresszre gyakorolt hatását vizsgálja, elismerjük, hogy ez segíthetett volna az eredmények értelmezésében. Másodszor azonban az MD-t egészséges patkányoknak adták be; az MD oxidatív károsodásra gyakorolt hatása a mentális betegségek állatmodelljeiben eltérő eredményeket mutathat.
Érdekütközések összeférhetetlensége
A szerzők kijelentik, hogy e cikk publikálásával kapcsolatban nem áll fenn érdekellentét.
Köszönet
A Neurotudományok Laboratóriuma (Brazília) a Nemzeti Transzlációs Orvostudományi Intézet (INCT-TM) egyik központja és a Santa Catarina-i Alkalmazott Idegtudományi Kiválósági Központ (NENASC) egyik tagja. Ezt a kutatást a CNPq, a FAPESC, az Instituto Cérebro e Mente és az UNESC támogatásával végezték. João Quevedo a CNPq kutatója, Roger B. Varela, Wilson R. Resende és Amanda V. Steckert pedig a CAPES hallgatói ösztöndíjasai; Samira S. Valvassori a CNPq hallgatói ösztöndíjasa.