Az emlősök nemi kromoszómáinak speciális szerepe van a hím (XY) és női (XX) csírasejtek fejlődésében (1). A nemi kromoszóma rendellenességek az emberi meddőség leggyakoribb genetikai okai (2). A Klinefelter (XXY) és a kettős Y (XYY) szindrómában a nemi kromoszóma triszómiák (SCT) esetében a spermatogenezis az X-, illetve Y-gén felesleg miatt zavart szenved (2). Az XYY férfiak általában termékenyek a felesleges nemi kromoszóma spontán elvesztése (mozaikizmus) miatt. Az XXY férfiaknál a mozaikosság ritkábban fordul elő. A heresperma kinyerése lehetővé tette néhány fiatal Klinefelter-férfi reprodukcióját, de idősebb betegeknél kevésbé sikeres (3, 4). Az XY csírasejtek nélküli XXY és XYY egyének terméketlenek.

Az SCT meddőség tanulmányozására felnőtt XXY és XYY egereket hoztunk létre, amelyek a Blimp1-mVenus (BV) és Stella-ECFP (SC) fluoreszcens riporter transzgéneket hordozzák (5) a pluripotens őssejtek primordiális csírasejt-szerű sejtekké (PGCLC-k) történő differenciálódásának nyomon követésére (6). Az XXY hímeket egy vad típusú nőstény és egy XY-tartalmú spermiumot termelő, nemi kromoszóma-variáns hím párosításával hoztuk létre (S1 ábra). Az XYY egerek előállításához mindkét szülőtől Y kromoszóma öröklődése szükséges. Ezért apai úton öröklődő vad típusú Y-kromoszómát és anyai úton öröklődő Yd1 kromoszómát használtunk, amely nem expresszálja a herét meghatározó Sry-t (S1 ábra) (7). Amint azt korábban kimutattuk (8, 9), a spermatogenezis fenotípusa mindkét modellben megismételte az SCT-emberekét, XXY egerekben a prospermatogonális stádiumban, XYY egerekben pedig a pachynema stádiumban megállt (S2 ábra). A spermatogenezis normális volt az euploid XY BVSC transzgenikus testvérekben.

A következő lépésben SCT és kontroll XY és XX egerekből származó fibroblasztokat hoztunk létre (1A ábra). Az X gén Slx és az Y gén Sly DNS-fluoreszcens in situ hibridizációja (DNS-FISH) megerősítette, hogy a 4. passzázs (P4) SCT és kontroll fibroblasztok megtartották eredeti nemi kromoszóma-komplementjüket (1B ábra és S3A ábra). A fibroblasztokat doxiciklin (Dox) indukálható módon indukált pluripotens őssejtekké (iPSC-k) (10) programoztuk át. Az így kapott P2 iPSC-ken DNS-FISH-t végeztünk (1A ábra).

A SCT-eredetű iPSC-vonalak nagy hányada mutatott nemi kromoszóma-vesztést. XXY egerekből XY, XX és XO iPSC-ket figyeltünk meg (1. ábra, C és E). A veszteség előfordulása hasonló volt az X és Y kromoszómák esetében (P = 0,062, Mann-Whitney teszt). XYY egerekből XY és XO iPSC-ket figyeltünk meg (1. ábra, D és E). Az XYY hímekben az Y kromoszóma elvesztése hasonló gyakorisággal fordult elő, mint az XXY hímekben az X és Y kromoszóma együttes elvesztése (P = 0,089, Mann-Whitney-teszt). Ezután összehasonlítottuk a nemi kromoszóma elvesztésének gyakoriságát az SCT-ből származó és az euploid XY- és XX-ból származó iPSC-k között. A nemi kromoszóma veszteség gyakoribb volt az SCT-, mint az euploid származású iPSC-kben (1E ábra), függetlenül a nemi kromoszóma veszteség meghatározásához használt határértéktől (S12D ábra).

A nemi kromoszóma veszteség az SCT sejtek átprogramozása során vagy az iPSC P2-re történő szaporítása során következhetett be, talán proliferatív előnyt biztosítva a keletkező euploid sejteknek. Valóban megfigyeltek nemi kromoszóma-instabilitást pluripotens őssejtekben (11, 12). Az utóbbi hipotézis tesztelésére elemeztük a P2 és P6 közötti nemi kromoszóma-stabilitást az erősen szülői (>90%) komplementer iPSC-kben (S4A ábra). Nemi kromoszóma veszteséget figyeltünk meg az XX és XXY iPSC vonalakban (P < 0,01 és 0,05, illetve; Wilcoxon signed-rank teszt), de nem az XY és XYY iPSC vonalakban (P = 0,21 és 0,66, illetve; Wilcoxon signed-rank teszt). Azonban egyetlen iPSC vonal sem mutatott 15%-nál nagyobb mértékű csökkenést a szülői komplementben (S4B ábra). Továbbá a P2 és P6 közötti nemi kromoszóma-vesztés nem volt triszómiás (S4B ábra). Az SCT-ből származó euploid XY iPSC-k szintén nem mutattak proliferatív előnyt az XXY vagy XYY iPSC-kkel szemben (S5. ábra). Mivel az SCT fibroblasztok kariotípusosan is stabilak voltak (1B. ábra és S3A ábra), a kromoszómavesztés valószínűleg az iPSC átprogramozás során indukálódik, és így különbözik a pluripotens őssejtek nemi kromoszóma-instabilitásától (11, 12). A jelenséget triszómiás kromoszómavesztésnek (TCL) nevezzük.

A következőkben azt határoztuk meg, hogy az SCT fibroblasztokból származó euploid XY iPSC-k képeznek-e funkcionális spermiumokat. Kiválasztottuk a Dox-mentes közeghez adaptált, erősen euploid (a sejtek ≥80%-a XY) P6 iPSC-ket (S6. ábra). XYY kísérleteinkhez csak olyan XY iPSC vonalakat használtunk PGCLC-kísérletekhez, amelyek megtartották a vad típusú Y, nem pedig az Yd1 kromoszómát (S7. ábra). A kariotipizálás megerősítette, hogy az összes SCT-ből származó XY iPSC vonal és egy kontroll XY iPSC vonal euploid volt (S8. ábra). Ezeket az iPSC-vonalakat epiblaszt-szerű állapoton keresztül differenciáltuk (6), hogy BV és SC pozitív PGCLC aggregátumokat hozzunk létre (2A ábra). A BV-pozitív PGCLC-ket (S1. táblázat) fluoreszcencia-aktivált sejtválogatással (FACS) izoláltuk (2B. ábra), és csírasejthiányos W/Wv (Kit mutáns) herékbe transzplantáltuk (13).

A recipiensek spermatogenezisét 9-10 héttel a transzplantáció után értékeltük. Az iPSC-eredetű PGCLC transzplantáció után megfigyelt teratomák (6) az XXY-eredetű és az XYY-eredetű transzplantált vonalak 29%-ában és 50%-ában voltak jelen (S9. ábra). A spermatogenezis helyreállítása, amelyet a spermatogén kolóniák jelenléte (2C ábra) és a szövettan (2D ábra) mutatott ki, valamennyi felhasznált XXY- és XYY-eredetű iPSC-vonal esetében megfigyelhető volt (1. táblázat). Így az SCT-ből származó XY iPSC-k képesek in vitro csírasejtekké differenciálódni és a transzplantációt követően befejezni a spermatogenezist.

Azt a kérdést tettük fel, hogy a transzplantációval létrehozott spermiumok támogathatják-e a reprodukciót. Két XXY- és két XYY-ból származó XY iPSC-vonalból származó spermiummal végzett intracitoplazmatikus spermiuminjekció (ICSI) (2E ábra és S10A ábra) zigótákat hoztak létre, amelyek in vitro kétsejtű embriókká fejlődtek (hatékonyság 76 .7 és 87,3% között) (2F ábra, S10B ábra és S2 táblázat), és durván normális utódokat, amikor recipiensekbe transzplantálták őket (hatékonyság 46,9 és 59,4% között) (2G ábra, S10C ábra és S2 táblázat). A polimeráz láncreakció genotipizálása megerősítette, hogy az utódok a transzplantált PGCLC-kből származnak (S10D ábra). Az XXY- és XYY-eredetű iPSC-vonalakból származó kölykök hasonló növekedést mutattak, mint a kontroll XY iPSC-kből származó kölykök (S10E ábra). Figyelemre méltó, hogy az XXY- és XYY-eredetű kölykök euploid (XY vagy XX) komplementerekkel rendelkeztek (S11. ábra). Minden XXY- és XYY-eredetű iPSC-vonalból három érett hímet és három nőstényt párosítottunk egymással, és mindegyik termékeny volt (2H ábra és S10F ábra). Így az SCT-eredetű XY iPSC-kből származó spermiumok kromoszómiailag normális, egészséges és termékeny utódokat hoznak létre.

Foglalkoztunk azzal, hogy a TCL specifikus-e a nemi kromoszómák triszómiájára. Mivel teljes autoszómára vonatkozó triszómiával rendelkező egérmodellek nem állnak rendelkezésre (14), megismételtük kísérleteinket hím Tc1 transzkromoszómás egereken, egy Down-szindrómás modellben, amely egy járulékos emberi 21-es kromoszómával (hChr.21) rendelkezik (15). A Tc1 egerek egy hChr.21-beillesztett neomicinrezisztencia kazettát hordoznak, amelynek szelekciója csökkenti a hChr.21 mozaikosságot (15). Ezért először felnőtt Tc1 fibroblasztokat dúsítottunk a hChr.21 jelenlétére a G418 neomicin analóg segítségével (3A ábra). A DNA-FISH kimutatta, hogy a Tc1 fibroblasztok túlnyomó többsége (≥96%) megtartotta a hChr.21-et (3B ábra és S3B ábra). Ezeket a Tc1 fibroblasztokat G418-szelekció nélkül újraprogramoztuk, és az így kapott iPSC-ket P2-ben elemeztük. A létrehozott 16 iPSC-vonalból tízben (62,5%) a sejtek ≥10%-ában a hChr.21 elvesztését mutatták ki (3. ábra, C és D, valamint S12D ábra). Ezzel szemben a G418 eltávolítása után a hChr21 megmaradt a Tc1 fibroblasztokban, amelyeket az iPSC átprogramozáshoz használt időtartammal megegyező ideig (18 nap) tenyésztettek, valamint a P6 iPSC vonalakban, amelyek P2-nél erősen szülői (>90% hChr.21 pozitív) komplementekkel rendelkeztek (S12. ábra, A és B). Arra a következtetésre jutottunk, hogy a hChr.21 elvesztését a Tc1 sejtekben inkább az átprogramozás, mint a G418 eltávolítása segíti elő, és ezért a TCL egy járulékos kromoszómát is érint.

A következő kérdésünk az volt, hogy a TCL előfordul-e emberi sejtekben. Humán triszómás sejtek tenyésztése során megfigyeltek kromoszóma-vesztést (16, 17), de ennek gyakoriságát és az átprogramozással való kapcsolatát nem elemezték szisztematikusan. Kiválasztottunk humán Klinefelter-szindrómás, Down-szindrómás és euploid XY és XX fibroblasztvonalakat, amelyek minimális mozaikizmust mutattak (S13 ábra, A és D), újraprogramoztuk őket, és meghatároztuk az így kapott iPSC-vonalak kromoszómakomplementjeit. XY és XX iPSC-ket figyeltünk meg Klinefelter-szindrómás fibroblasztokból és euploid iPSC-ket Down-szindrómás fibroblasztokból (S13. ábra, B, C, F és G). A kromoszómavesztés gyakoribb volt a triszomikus, mint a diszomikus sejtekben, ami azt mutatja, hogy a TCL a humán újraprogramozás során is előfordul. A magasan euploid iPSC-vonalak gyakorisága azonban alacsonyabb volt, mint a triszómiából származó egér iPSC-kben megfigyelt gyakoriság (S13 ábra, F-H).

Megmutattuk, hogy a TCL euploid iPSC-ket állít elő SCT és autoszomális triszómiás egerekből és betegekből (S12E ábra). Egerekben az így kapott “korrigált” iPSC-k képesek funkcionális spermiumokat képezni, lehetővé téve kromoszómálisan euploid utódok előállítását terméketlen SCT egyénekből. A TCL kiegészíti a kromoszóma-rendellenességek kezelésére szolgáló meglévő iPSC-terápiákat (17-21). A TCL-t okozó mechanizmusok ismeretlenek. Az átprogramozással járó sejtszintű stressz szelektálhat a triszómás sejtek ellen, lehetővé téve az euploid sejtek kialakulását. Emberi sejtekben ritkábban figyeltünk meg TCL-t, mint egérsejtekben (S12D és S13H ábra). Még ha ritka is, a TCL olyan terméketlen SCT-páciensek számára kínálhat kezelést, akiknél az alternatív megközelítések sikertelenek. Az in vitro előállított humán csírasejtek klinikai felhasználását azonban etikai és jogi szempontból gondosan meg kell fontolni (22-24). Ezenkívül teljes in vitro spermatogenezist kell kifejleszteni, hogy elkerülhető legyen a csírasejt-transzplantáció során kialakuló teratóma kialakulásának kockázata.

A TCL lehetővé teszi női iPSC-k előállítását férfiakból is, ami lehetőséget kínál a szexuális dimorfizmusok genetikai feltárására (25). Olyan izogén iPSC vonalak létrehozásával, amelyek csak a nemi kromoszómák tekintetében különböznek, az iPSC betegségmodellezés során azonosított nemi különbségeket X vagy Y kromoszómális hatásoknak lehetne tulajdonítani.