6.2.3 Cowpea Mosaic Virus

A tehénborsó mozaikvírus (CPMV; Comovirus, Comoviridae) a különböző konjugációk és biotechnológiai alkalmazások legkiterjedtebben vizsgált platformja. Ez egy 30 nm-es ikozaéderes vírus, amely kétrészes pozitív értelmű, egyszálú RNS-genomból áll, és minden egyes RNS-molekula külön részecskében van kapszidálva. A CPMV-kapszid két különböző CP-alegység (kis, 24 kDa és nagy, 42 kDa) egyenként 60 példányából áll, pszeudo T = 3 ikozaéderes szimmetriával. A kapszid erősen szimmetrikus és heteromer jellegéből adódóan a CPMV figyelemre méltó lehetőséget nyújt többféle funkcionalitás differenciált bevezetésére (ötszörös vagy háromszoros vagy mindkét pozícióban) specifikus genetikai és kémiai tervezéssel, a térbeli eloszlás és a többértékűség mértékének ellenőrzésével (Uchida et al., 2007; Young et al., 2008; Steinmetz, 2010; Wen et al., 2016). A CPMV nagy mennyiségben tisztítható fertőzött levelekből, és széles hőmérséklet-tartományban (60 °C-ig) és a 3,0-9,0 közötti pH-tartományban stabil, valamint ellenáll bizonyos szerves oldószereknek (Steinmetz és mtsai., 2009). A CPMV-kapszidokat aktív enzimek kontrollált immobilizálására használják. A CPMV-kapszidok felhasználása fém nanorészecskék sablonos előállítására elektrolízis nélküli leválasztással (ELD) és különböző eljárásokkal történő mineralizálással lehetővé tette fémek és ötvözetek vékony, egyenletes vastagságú és összetételű rétegeinek előállítását. A CPMV-vírusokat nano-építőelemként használják 2-D és 3-D struktúrák alulról felfelé történő, rétegről-rétegre (LbL) történő ellenőrzött felépítéséhez, nanoelektronikai eszközökként vagy elektrokémiai többszörös bioszenzorokként való potenciális alkalmazásokhoz (áttekintés: Culver et al., 2015; Wen et al, 2015a, 2016; Narayanan és Han, 2017a).

A natív CPMV és a lantanid fémkomplexekkel derivatizált CPMV-részecskék biztonságosnak és nem toxikusnak bizonyultak, e részecskék in vivo biodisztribúciós, toxicitási és patológiai vizsgálatai alapján (Rae et al., 2005; Singh et al., 2007). A CPMV-ről megállapították, hogy egerekben a központi idegrendszer (CNS) fertőzése során gyulladásos régiókhoz kapcsolódik, és vér-agy gát megszakítását idézi elő (Shriver és mtsai., 2009). A felszíni PEGilálással ellátott CPMV alacsony immunogenitást mutatott, és az internalizációt számos sejttípusban megakadályozták a nem specifikus kötődés csökkenése miatt (Raja és mtsai., 2003). Manchester és munkatársai felfedezték, hogy a fluoreszcensen jelölt CPMV endogén módon képes felvenni az érrendszeri endotélsejtekbe, és intravitalis képalkotó szondaként használható az érrendszer és a véráramlás akár 500 μm mélységig történő vizualizálására 72 órán keresztül élő egér- és csirkeembriókban (Lewis és mtsai., 2006). A CPMV-ről megállapították, hogy természetes módon képes kötődni a felszíni vimentinhez, a sejtek architektúráját és dinamikáját moduláló citoszkeletális fehérjéhez, és endotél-, rák- és gyulladásos sejtekben túlreprezentáltnak bizonyult (Koudelka és mtsai., 2009). A CPMV biokompatibilis, természetes kölcsönhatását a vimentinnel és az endotheliumot visszatartó tulajdonságait tovább hasznosították a tumor angiogenezis és a tumor homing in vivo leképezésére (Leong et al., 2010; Steinmetz et al., 2011; Yildiz et al., 2011; Wen et al.., 2015a).

A CPMV-kapszid külső felületét széles körben módosították a természetben előforduló vagy genetikailag módosított exponált lizin-, cisztein-, tirozin-, valamint aszparagin- és glutaminsav-maradékok felhasználásával, standard kémiai konjugációs módszerek és konjugáló keresztkötőanyagok segítségével számos reagens, például Au nanorészecskék rögzítéséhez, redox-reaktív metil-viologén-részek, fémorganikus ferrocén-karboxilát-részek, fluorofórok, biotin, PEG-láncok, sztilbén-származékok, szénhidrátok, heterológ fehérjék (pl.g., humán holo-transzferrin, T4 lizozim, az internalin B LRR domianja és a HER2 tirozinkináz receptor Intron 8 génterméke), antitestek, oligonukleotidok, félvezető kvantumpontok és fullerének. A természetellenes aminosavak beépítését a CPMV-kapszidba több ortogonális kémiai módszerrel (például kemoszelektív hidrazon-ligációs stratégiával és rézkatalizált azid-alkin-cikloaddíciós (CuAAC) vagy “click”-reakcióval) végeztük. Ezek az erőfeszítések elősegítették a CPMV-részecskék optikai szondaként, vakcinajelöltként, valamint memória- és szenzor-nanoeszközökként való felhasználását (áttekintés: Young és mtsai., 2008; Destito és mtsai., 2009; Grasso és Santi, 2010; Steinmetz, 2010; Lomonossoff és Evans, 2011; Wen és mtsai., 2015a; Zhang és mtsai., 2016; Lee és mtsai., 2016b; Narayanan és Han, 2017a). A CPMV-t és a TMV-t úgy töltötték fel, hogy kontrasztanyagokat hordozzanak a kettős modalitású mágneses rezonancia (MR) és optikai képalkotáshoz, és mindkét modalitásban kimutatták a fibrin megkötésének specificitását in vitro a célzott peptidek jelenlétében. Preklinikai vizsgálatok a trombózis arteria carotis fotokémiai sérüléses modelljében megerősítették a nanoszondák trombus-homingját, ahol a hosszúkás TMV rudak szignifikánsan nagyobb kötődést mutattak a trombusokhoz, mint az ikozaéderes CPMV (Wen és mtsai., 2015b,c). Az E7p72 peptidekkel (nagy affinitású epidermális növekedési faktor-szerű 7-es doménhez (EGFL7) kötődő peptid, amely specifikusan az emberi endotélsejteket célozza meg) díszített CPMV nagy specificitással célozta meg a tumorhoz kapcsolódó neovaszkulátumot, ahogy azt intravitalis képalkotással értékelték (Cho et al., 2017).

A CPMV kapszid alegységek in vitro és in vivo összeszerelési protokolljai még nem jól kidolgozottak. Ez korlátozta a tehermolekulák kapszulázására szolgáló nanokonténerként való felhasználási lehetőségeit. A CPMV-vírusok natív nukleinsavtartalmát elektrosztatikus szivacsként használták képalkotó ágensek és terápiás molekulák egyszerű infúziós technikával történő vonzására (Yildiz és mtsai., 2013). A CPMV prekurzor (VP60), amely fuzionált nagy és kis fehérjékből és a VP60 proteolitikus feldolgozására szolgáló 24K proteinázból áll, növényekben történő tranziens koexpressziója CPMV VLP-ket (eCPMV) eredményezett, amelyek teljesen nélkülözték az RNS-t (sem a vírust, sem a gazdaszervezetet) (Saunders et al., 2009). Az ilyen üres kapszidokat számosféle rakománymolekula, például fémek, fluoreszcens festékek vagy gyógyszerek szállítására használták (Culver és mtsai., 2015; Wen és mtsai., 2015a; Narayanan és Han, 2017a). Fluorofórokat, biotin-affinitási címkéket, PEG-et és különböző peptideket szelektíven jelenítettek meg az üres CPMV belső felületén, reaktív lizinek megcélzásával (Wen és mtsai., 2012b). Az eCPMV mint in situ vakcina hatékonyságát bizonyították metasztatikus melanoma, emlőrák, petefészekrák és vastagbélrák egérmodelljeiben, ahol a neutrofilek aktivációjának és infiltrációjának kiváltásával tumorellenes immunválaszt indukált, ami az adaptív immunitás aktiválásához vezető kemo-/citokinprofilt eredményezett. A legtöbb egér, amelyet az ellenkező szárnyon lévő tumorral újrakezeltek, teljesen kilökte az újrakezelt tumort (Lizotte és mtsai., 2016). A mágneses nanorészecske (mNP) intratumorális adagolása a hipertermia és az eCPMV kiváltására kombinációban javította a helyi és szisztémás tumorkezelés hatékonyságát (a másodlagos tumor növekedésének késleltetése (abszkopális hatás) és a tumor újbóli kihívásának való ellenállás) C3H egér/MTG-B emlő adenokarcinóma és C57-B6 egér/B-16-F10 melanoma rákos sejtmodellben (Hoopes et al., 2017a). Nyolc spontán kutyarák (két orális melanoma, három orális amelioblastoma és egy karcinóma) felhasználásával Hoopes és munkatársai (2017b) kimutatták, hogy a hipofrakcionált sugárzás és az mNP-indukált hipertermia, valamint az intratumorális eCPMV-kezelés kombinációja fokozott immunválaszt vált ki.

A CPMV rákos sejtekbe történő célzott gyógyszeradagolásra való felhasználása, valamint a CPMV és az emlőssejtek közötti természetes kölcsönhatás leküzdése érdekében “click” reakciót alkalmaztak a PEG és a folát ligandumrész (CPMV-PEG-FA) CPMV-hez való konjugálására. Ez a konjugáció lehetővé tette a CPMV specifikus célzását a folsavreceptorokat (FR) expresszáló HeLa- és KB-sejtekre (Destito és mtsai., 2007). A CPMV neuroblasztóma tumorsejtekre történő célzását a CPMV genetikai módosításával értük el, hogy a neuropeptid Y (NPY) analógot mint célzási ligandumot jelenítse meg. Kimutatták, hogy a CPMV-NPY specifikusan kölcsönhatásba lépett az Y1 receptort túlreprezentáló SK-N-MC sejtekkel (Destito és mtsai., 2009; Ma és mtsai., 2012). A receptor-célzott képalkotást rövid peptidszekvenciák (a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor receptor-1 (VEGFR-1) specifikus F56 és bombesin), illetve a gasztrin-felszabadító peptid receptorok (GRPR) CPMV-hez történő lehorgonyzásával valósítottuk meg. Ezek a CPMV-alapú szenzorok specifikusnak bizonyultak az olyan rákos sejtekhez való kötődésben, amelyek felülreprezentálják ezeket a receptorokat a sejtfelszínen (Brunel és mtsai., 2010; Steinmetz és mtsai., 2011). Wen és Steinmetz (2014) egy bottom-up megközelítést dolgoztak ki CPMV nanorészecskék, dimerek és célzott ligandumokat (ciklikus RGD peptideket) és fluoreszcens festékeket tartalmazó összeállítások szintézisére, és megállapították, hogy az RGD peptidek szimmetrikus prezentációja és a nanorészecskék dimerizációja növelte a rákos sejtek célzásának hatékonyságát.

A CPMV-t sikeresen alkalmazták számos heterológ peptid megjelenítésére immunválasz kiváltására. Az állatok immunizálása az egyes kimérákkal erős humorális immunválaszt váltott ki, amely védelmet nyújtott az adott kórokozó általi kihívással szemben. Az antivirális molekulák és szénhidrátok multivalens megjelenítése a CPMV-n megkönnyítette azok terápiás célú felhasználását (Lomonossoff és Evans, 2011; Koudelka és mtsai., 2015; Hefferon, 2017). Aljabali és munkatársai (2013) a CPMV külső felületén található lizin- vagy ciszteinmaradványok segítségével a dox kovalens konjugációját hozták létre a CPMV-vel amidkötés vagy diszulfidhíd segítségével. A dox-szal terhelt CPMV még alacsony dózisban is nagyobb sejtölő hatást mutatott, mint a szabad dox. A negatív töltésű dendronok koronájával módosított CPMV-t pozitív töltésű fényérzékenyítők (fotodinamikus terápiához (PDT)) töltésére használták. Ez a hibrid PDT-CPMV hordozórendszer hatékonyan pusztította mind a melanomasejteket, mind a makrofágokat in vitro (Wen és mtsai., 2016). A háromértékű króm (egy jótékony ásványi tápanyag) dózist korlátozó, nem specifikus toxicitásának leküzdése érdekében, amely szelektíven gátolhatja a magas glükózzal indukált humán aorta simaizomsejtek (HASMC) proliferációját in vitro, infúzióval króm-kloridot töltöttek a CPMV belső üregébe, és az így kapott CrCl3-mal töltött CPMV-részecskék (CPMV-Cr) jelentősen csökkentették a glükóz-indukált HASMC-proliferációt, és antiatherogén hatást mutattak hiperglikémiás körülmények között (Ganguly és mtsai)., 2016).