összehasonlító genomika

Először is összehasonlítottuk a 61 uruguayi izolátumot SNP-analízis segítségével a P125109 genommal mint referenciával. Ez az elemzés azt mutatta, hogy a két legrégebbi izolátum több mint 600 SNP-vel különbözik a referencia genomtól (607 és 652 a 31/88 és 08/89 esetében), míg az összes többi 59 izolátum kétszáznál kevesebb SNP-vel (60 és 166 között) (1. kiegészítő táblázat). Másrészt az összes uruguayi genom 17 SNP-vel különbözik a P125109 genomtól.

Az SNP-k alapján végzett filogenetikai elemzés két klád létezését mutatta ki, amelyeket E1-nek és E2-nek neveztünk el (1. ábra (b)), és amelyek a 61 törzsből 57-et foglalnak magukban. Ez az 57 törzs a fő S. enterica serovar Enteritidis MLST 11-es szekvenciatípusához (ST-11) tartozik, és 1994 óta együtt kering az országban. A fennmaradó négy izolátum (31/88, 8/89, 77/02 és 89/02) a két klád egyikéhez sem tartozott (1. ábra b)). Korábban már beszámoltunk arról, hogy a két legrégebbi izolátum (31/88 és 8/89) az 1974-es MLST szekvenciatípushoz (ST1974) tartozik, és hogy az ST1974 egy jellegzetes profág felvétele után az ST11-ből származik8. A másik két izolátum (77/02 és 89/02) a törzsek többségéhez, az ST11-hez tartozik.

Az E1 klád 21 törzset foglal magában, amelyek mind az öt járványügyi időszakot átfogják, és amelyeket élelmiszerből, állati vagy emberi fertőzésekből izoláltak. Ezzel szemben az E2 kládot 36 izolátum képviseli, amelyek közül 34-et a járványokhoz kapcsolódó időszakokban izoláltak (1. ábra (a,b)). Ezért ésszerű a feltételezés, hogy az E2 egy olyan törzsvonal lehet, amely felelős volt a S. enterica serovar Enteritidis járványokért az országban.

Már korábban beszámoltunk 203 törzs filogenetikai elemzéséről, amely a S. enterica serovar Enteritidis EBG4 izolátumai között világszerte a szérumon belüli változatosságot képviseli, és amely a jelen vizsgálatban használt 61 uruguayi izolátumból 6-ot tartalmazott8. Mint most kiderült, e 6 törzs fele E1, fele pedig E2 (E1: 53/94, 206/99 és 214/02; E2: 8/02, 251/01 és 253/01), és e két csoport mindegyike szoros rokonságban áll az európai és észak-amerikai törzsekkel. Ezt a kapcsolatot az S1. kiegészítő ábra mutatja be, amely a korábban közölt filogenetikát tartalmazza, az e törzsek által alkotott kládra nagyítva. Ez arra utal, hogy az E1 és E2 széleskörű elterjedési mintázatot mutathat.

A feltételezés további alátámasztására újabb filogenetikai elemzést végeztünk, ezúttal a régióban izolált törzsekre összpontosítva, beleértve 12 argentin, 122 brazil és ugyanezen 61 uruguayi genomot (2. ábra (a)). Érdekes módon azt találtuk, hogy ezek a törzsek nagyon hasonló módon klasztereződtek, mint amit az uruguayi izolátumok között találtunk, azaz az E1 klaszter most Argentínából és Brazíliából származó törzseket tartalmaz, míg az E2 klaszter Brazíliából származó törzseket (103 az E1-ben és 62 az E2-ben). Tekintettel az EnteroBase-ben rendelkezésre álló argentin genomok alacsony számára, nem zárhatjuk ki annak lehetőségét, hogy az E2 vonal keringett ebben az országban. Mindhárom országból mindössze 30 törzs csoportosult az E1-en és az E2-n kívülre, amelyek közül 24-et 1994 előtt izoláltak (2. ábra a), 2. kiegészítő táblázat). Összességében eredményeink határozottan arra utalnak, hogy az E1 és E2 törzsek 1994 körül kerültek be a régióba, és azóta is keringenek Uruguayban, Brazíliában, Argentínában, Európában és Észak-Amerikában, ami alátámasztja azt az elképzelést, hogy mindkettő az Enteritidis szerovar vonalát alkotja.

(a) A 195 genom filogenetikai fája, beleértve 61 uruguayi (fehér levelek), 12 argentin (világoskék levelek) és 122 brazil (sárga levelek) genomot. Az E1 vonal ágai kékkel vannak színezve. Az E2 vonal ágai piros színnel vannak jelölve. A jobb oldali sávok különböző színekkel jelölik az ycdX, pduD, hsdM, ybiO, yiaN, aas és aceA allélváltozatait. Lásd a b) ponton belüli színlegendákat. A méretarányos sávegységek a változatok helyenkénti változásait jelölik. (b) Az ycdX, pduD, hsdM, ybiO, yiaN, aas és aceA különböző allélváltozatainak génkiigazításai. A gének az egyes variánsokat tartalmazó genomban annotált és a P125109 referenciához igazított géneket ábrázolják. Az illesztés bázispárokban (bp) kifejezett skáláját vízszintes sávok jelzik. Az egyes variánsokhoz kapcsolódó SNP-ket a referencia genomhoz viszonyítva az 1. táblázat részletezi. A nem szinonim változatokat okozó SNP-ket X → Y (egybetűs aminosavkóddal) jelöljük a génben elfoglalt helyükhöz képest. A szinonim SNP-ket csak a génben elfoglalt pozíciójához képest jelöltük (syn SNP).

Ezután összehasonlító genomikai elemzést végeztünk, amelynek célja az E1 és E2 vonalhoz kapcsolódó genetikai különbségek azonosítása volt, beleértve 165 genomot: 57-et Uruguayból, 11-et Argentínából és 97-et Brazíliából (2. ábra (a)).

Allelikus variánsok az E1 és E2 vonalak között

Mivel nem találtunk különbségeket a járulékos genomban az E1 és E2 vonalak között, SNP-k közötti különbségeket kerestünk a 165 kiválasztott törzs között. Ez az elemzés azt mutatta, hogy az E1 és E2 közötti fő különbségek három génben találhatók: ycdX, pduD és hsdM. Ezek a gének az E1 genomban megszakadtak az E2 genomban található megfelelőikhez képest. Ezenkívül négy másik génben, az ybiO, yiaN, aas és aceA génekben is találtunk olyan allélváltozatokat, amelyek mindkét vonalra specifikusak (2. ábra (a,b); 1. táblázat).

A 103 E1 törzs (11 argentin, 71 brazil és 21 uruguayi) mindegyike 4 bázispárnyi inszerciót mutat az ycdX génben (SEN1912), szemben a referenciával és az összes E2 törzzsel (1. táblázat). Ez az inszerció egy korai stop kodont vezet be, ami egy pszeudogént vagy a fehérje csonka változatát eredményezheti (2. ábra (b) és 1. táblázat). Az ycdX gén egy hidrolázt kódol, amely a PHP-fehérjék szupercsaládjába tartozik, amelyek NH2-terminális php-domént (polimeráz-hisztidinol-foszfatáz) tartalmaznak. Ez a domén a baktériumok DNS-polimeráz III alfa alegységére jellemző, és részt vesz a lektorálási funkcióban22. Azt feltételezték, hogy az YcdX részt vesz az E. coli DNS-javító útvonalakban, és nukleázként vagy foszfatázként működhet ezekben az útvonalakban23. Nemrégiben Wang és munkatársai két allélváltozatot találtak erre a génre (nem szinonim SNP) a S. enterica serovar Enteritidis izolátumok között, amelyek jelentősen eltérő képességgel rendelkeznek a tojásfehérjében való túlélésre24. Inoue és munkatársai kimutatták, hogy az ycdY (az ycdWXYZ operon szomszédos génje) mutációja a rajzás elnyomását okozta E. coli-ban25.

Az E2 vonalhoz tartozó törzsek mindegyike ugyanazt az allélváltozatot mutatja a pduD génre (SEN2039), míg az E1 vonalhoz tartozó 103 törzsből 102-ben olyan báziscsere történt, amely egy stop kodont vezetett be, hasonlóan az ycdX esetében megfigyelthez (1. táblázat). A fennmaradó törzsből (azaz az uruguayi 11/07-es törzsből) teljesen hiányzik a pduD gén (2. ábra b) és 1. táblázat). A pduD egy propanediol-dehidratázt kódol, amely a pdu operon része, amely az 1,2-propándiol katabolizmusához szükséges összes fehérjét kódolja. Ez az operon, amelyet laterális géntranszferrel szereztek meg a Salmonellában26,27 , megszakadt különböző szerovarokban, amelyek invazív extraintestinális fertőzéseket okoznak az emberben, mint többek között a Typhi és a Paratyphi A28. Faber és munkatársai arról számoltak be, hogy ennek az operonnak a működése fontos lehet a bélmikrobiótával való versenyben, mivel az 1,2-propándiol olyan anyagcsere-termék az anaerob bélkörnyezetben, amelyet a Salmonella felhasználhat, ha a tetrationátos anaerob légzéshez kapcsolódik29. Azt javasolják, hogy az 1,2 propándiol felhasználásának képessége lehetővé teszi a kórokozó populáció bővülését a bélben, növelve a széklettel történő kiválasztást, ami fontos tényező a járványok terjedésében29.

Az E2 törzsek mindegyike rendelkezik a hsdM gén (SEN4290) ugyanazon allélváltozatával, de az E1 törzsek között több variáns is létezik erre a génre (2. ábra (b) és 1. táblázat). Az E1 törzsek többsége a hsdM olyan variánsait tartalmazza, amelyek vagy egy csonka változatot (a 6 variánsból 4), vagy a fehérje nem szinonim szubsztitúcióját eredményezik. Az E1-ben csak három törzs (köztük az uruguayi 44/07) rendelkezik az E2-vel azonos variánssal, ami arra utal, hogy csak az E1 törzsekben hajlamos a hsdM mutációk felhalmozódására (2. ábra (b)). A hsdM gén egy olyan DNS-metilázt kódol, amely részt vesz az enterobaktériumok I. típusú restrikciós-módosító rendszerében (RM)30,31 . Korábbi jelentések a virulencia-gének expressziójára gyakorolt epigenetikai hatások miatt a 2-es típusú restrikciós módosító rendszereket a Salmonella patogenitásával hozták összefüggésbe32. Silva és munkatársai kimutatták, hogy az RM gének mutációi károsodott fenotípust eredményeznek az invazív szalmonellózis egérmodelljében33. Az 1. típusú RM-rendszereket a Yersinia pseudotuberculosis patogenitásában való részvételként is leírták34.

Mivel az E2, de az E1 nem rendelkezik az ycdX, a pduD és a hsdM intakt másolataival, és figyelembe véve, hogy ezeket a géneket korábban a Salmonella patogenitásában már érintették, arra lehet következtetni, hogy ez a három gén fontos lehet az E2 törzsek járványképessége szempontjából. Az intra-serovar diverzitást reprezentáló globális filogeniában is kerestük az allélváltozatokat (1. kiegészítő ábra és 8. hivatkozás), és azt találtuk, hogy a domináns allél minden esetben az E2 allél, míg a megszakított változatok az E1-re specifikusak (az adatok nem láthatóak).

Mint már említettük, további négy gén, az ybiO, yiaN, aas és aceA esetében találtunk kisebb szekvencia különbségeket a két vonal között. Ez a négy gén egyetlen variánst mutat az E2 törzsekben, míg az E1 nagyrészt megegyezik a P125109 referencia törzzsel.

Az összes E2 törzs az ybiO gén (SEN0772) egy bizonyos allélváltozatát mutatja, amely a fehérjében egy Gly(601)→Arg szubsztitúciónak köszönhető (2. ábra (a,b), 1. táblázat). Az ybiO gén egy feltételezett mechanoszenzitív csatornafehérjét kódol, amely részt vesz az ozmotikus adaptációban, és hipo-ozmotikus sokk hatására aktiválódik E. coli-ban35. Korábban arról számoltak be, hogy a S. enterica serovar Enteritidis izolátumok között két allélvariáns létezik erre a génre vonatkozóan, amelyek eltérő képességgel rendelkeznek a tojásfehérjében való túlélésre24. A yiaN (SEN3494) (L-dehidroaszkorbát-transzporter nagy permeáz alegység, feltételezett membránfehérje) esetében minden E2 genomban ugyanaz az allél található, amely az E1-hez képest Gly(163)→Ala-ban különbözik. Hasonlóképpen, az összes E2 osztozik az aas (2-acil-glicerofoszfo-etanolamin aciltranszferáz/acil-ACP-szintetáz, SEN2853) és az aceA (izocitrát-liáz, SEN3966) gének azonos variánsán. Az E1-ben a legtöbb törzs aas génje megegyezik a referenciával, néhány törzs pedig vagy nem szinonim szubsztitúciót (5 törzs) vagy szinonim szubsztitúciót (1 törzs) mutat (2. ábra a), 1. táblázat). Hasonlóképpen, az aceA gén egy kivételével az összes E1 genomban azonos a referenciával.

Összefoglalva, azt találtuk, hogy az ybiO, yiaN, aas és aceA E2 alléljai specifikusak erre a vonalra.