mecA gene PCR

A 188-bp fragmentum a mecA génben és egy 178-bp fragmentum a S. aureus-specifikus Sa442 génből az 1. és 2. izolátum esetében különálló reakciókban, LightCyclerrel (Roche Diagnostics GmbH, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Németország), SYBR green segítségével, Mec-S és Mec-A, illetve Sa442-F és Sa442-RS primerekkel amplifikáltuk, a korábban leírtak szerint (5). A mecA-pozitív izolátumok SYBR green olvadási hőmérséklete 79°C volt. Az Sa442-pozitív izolátumok szintén 79°C-os SYBR-zöld olvadási hőmérsékletet generálnak. A S. aureus ATCC 29213 (oxacillinre érzékeny) és a S. aureus ATCC 43300 (oxacillinrezisztens) a Sa442 gén kontrolljaként, a mecA gén negatív, illetve pozitív kontrolljaként használtuk. A kontrollokkal ellentétben az 1. és 2. izolátum esetében nem keletkezett mecA vagy Sa442 termék. További PCR-t végeztünk a mecA gén nagyobb, 533 bp hosszúságú fragmentumának kimutatására (4). Az 1. és 2. izolátumban és a S. aureus ATCC 29213-ban nem keletkezett termék, de a várt méretű termék keletkezett a S. aureus ATCC 43300-ban. A pozitív kontrollként használt 16S rRNS-gén minden törzsből amplifikálódott (az adatok nem láthatóak).

A S. aureus meticillinrezisztenciájának pontos és időben történő kimutatása a klinikai mikrobiológiai laboratórium fontos feladata (20). Míg a mecA gén PCR-rel történő kimutatása az arany standard, a PBP2a latex agglutinációs teszt egyszerű és gyors tesztnek bizonyult, amely jó teljesítményjellemzőkkel rendelkezik mind a S. aureus, mind a koaguláz-negatív staphylococcus fajok meticillinrezisztenciájának kimutatására, annak ellenére, hogy egyes esetekben előzetes indukcióra van szükség (1, 21). A PBP2a-teszt a PBP2a ellen termelt monoklonális antitestekkel érzékenyített latexrészecskéket használ (11). E teszt specificitása állítólag megközelíti a 100%-ot (18, 19). Bár nincsenek jelentések a PBP2a latex agglutinációs tesztek S. intermedius izolátumokra vonatkozó teljesítményéről, két S. warneri izolátum esetében hamis pozitív PBP2a eredményt észleltek, az egyik 1 perc, a másik 6 perc alatt, amelyek mindketten mecA PCR negatívak voltak, és az oxacillin MIC értéke ≤0,5 μg/ml volt (21). A gyártó betegtájékoztatója szerint a hamis pozitív reakciók általában gyenge agglutinációk, amelyek gyakran negatívak a friss tenyészettel végzett ismételt vizsgálat során. Mi azonban azt találtuk, hogy két izolátumunk többszöri szubkultúrát követően ismételten pozitív volt, az egyik közülük erősen pozitív. A S. intermedius ATCC 29663 törzs valójában negatív volt a PBP2a-teszttel, de fenotípusosan is különbözött a két klinikai törzstől a pozitív mannitfermentáció, a β-laktamáz-negativitás és a penicillinérzékenység tekintetében (az eredmények nem láthatóak).

A koaguláz-pozitivitást általában arra használják, hogy a Staphylococcus spp. izolátumainak klinikai jelentőséget és patogenitást tulajdonítsanak. Míg a klinikai laboratóriumban izolált koaguláz-pozitív staphylococcus leggyakrabban a S. aureus, a S. intermedius, S. delphini, S. schleiferi subsp. coagulans, S. lutrae és a S. hyicus egyes törzsei szintén koaguláz-pozitívak (1). A laboratóriumok a koaguláz-pozitív staphylococcusok azonosítására gyakran használják a szabad koaguláz vagy az A fehérjével és a fehérje nélküli csomósodási faktor kimutatására szolgáló tesztek kombinációját. A S. intermedius izolátumok pozitívak a szabad koagulázra, de negatívak az A fehérjére, és az izolátumok 14%-a rendelkezik csomósodási faktorral, ami megmagyarázza az 1. izolátum pozitív dia koagulázát és a gyenge pozitív BACTi Staph latexet (6). Amint azt korábban leírtuk, a pirrolidonil-arilamidáz-pozitivitást gyors módszernek találtuk annak megállapítására, hogy egy koaguláz-pozitív staphylococcus nem S. aureus (10). Úgy véljük, hogy eseteink arra utalnak, hogy a S. intermedius valódi előfordulását az emberi sebfertőzésekben valószínűleg alábecsülik, mivel az összes koagulázpozitív staphylococcust gyakran egy kalap alá veszik S. aureusnak (17). A S. intermedius fenotípusos vagy biokémiai módszerekkel történő végleges azonosításának hiányában a 16S rRNS gén szekvenálása hasznosnak bizonyult a Staphylococcus és Macrococcus fajok taxonómiai osztályozásához (8).

Egy 1989-es első tanulmány szerint a kutyák ínyéből és kutyák által okozott sebfertőzésekből származó S. intermedius izolátumok 72%-a érzékeny volt penicillinre, és egyik sem volt rezisztens oxacillinnel szemben (16). Egy újabb vizsgálat kimutatta, hogy az oxacillinrezisztencia egyre nagyobb problémát jelent a S. intermedius izolátumokban: a kutyák orrából, szeméből és tályogjából származó izolátumok esetében 60-85%-kal nagyobb oxacillinrezisztencia arányt figyeltek meg, mint a többi helyről származó izolátumok esetében (7). A meticillin-rezisztens S. intermedius okozta első humán fertőzésben, ahol ez volt a tüdőgyulladás kórokozója, az oxacillin MIC 32 μg/ml volt (3). Mindkét izolátumunk penicillinrezisztens és β-laktamáz pozitív volt; az oxacillin MIC értéke ezeknek az izolátumoknak 0,125 μg/ml volt. Ezen izolátumok penicillinrezisztenciája – a negatív mecA PCR-rel és a β-laktám/β-laktamáz gátló kombinációkra való érzékenységgel járó oxacillinrezisztencia hiányában – a β-laktamáz vizsgálat pozitív eredményével magyarázható. A mecA gén 533 bp hosszúságú fragmentumát célzó primer-készletet használva Gortel és munkatársai megerősítették, hogy a mecA gén meticillinrezisztenciát kölcsönöz a kutyákból izolált staphylococcusokban (4). Ezek a kutatók megállapították, hogy a mecA-t hordozó 10 koaguláz-pozitív staphylococcustörzs közül 9 S. aureus és 1 S. intermedius volt. Feltételezték, hogy a S. intermedius és a S. aureus meticillinrezisztenciájának eltérő gyakorisága a fajok közötti eltérő mecA szabályozásnak vagy az S. intermediusra nehezedő intenzív antibiotikum-szelekciós nyomás hiányának tudható be (4). Bár a koaguláz-pozitív staphylococcusokra vonatkozóan nincsenek specifikus NCCLS értelmezési kritériumok a S. aureuson kívül, az oxacillinérzékenység fenotípusos és genotípusos módszerekkel (mecA gén PCR két, 188 és 533 bp hosszúságú fragmentumokat célzó primer-készlettel) végzett vizsgálatának eredményei, valamint a korábban az oxacillin-rezisztens S. intermediusra vonatkozóan közöltekhez képest alacsony oxacillin MIC-értékek kombinálva. intermedius izolátumokhoz képest (MIC > 4 μg/ml), az e vizsgálatban szereplő 1. és 2. izolátumot oxacillinérzékenynek minősíti (3, 4).

Mert elfogadott, hogy a S. aureus meticillinrezisztenciája elsősorban a mecA gén által kódolt további penicillinkötő fehérje, a PBP2a megszerzésének köszönhető. A mecA gén eredetének keresése egy lehetséges evolúciós előfutár azonosításához vezetett a S. sciuri-ban, egy állatközösségi élőlényben. A S. sciuri mecA homológja 79,5%-os DNS-szekvencia hasonlóságot mutatott a S. aureus mecA génjével és 88%-os aminosav azonosságot a PBP2a génnel. A S. sciuri mecA homológja a természetben nem kölcsönöz rezisztenciát a meticillinnel szemben. Couto és munkatársai azonban emberből származó meticillin-rezisztens S. sciuri izolátumokat azonosítottak, amelyekben a mecA homológnak a szerkezeti gén előtt egy IS256 elem beillesztésével vagy a promóter régió egynukleotidos módosításával létrejött túlexpressziója a PBP2a-ra funkcionálisan hasonlító fehérje termelődését eredményezte (2). A S. sciuri izolátumokhoz hasonlóan az itt leírt S. intermedius izolátumok is tartalmazhatnak egy PBP2a-szerű fehérjét kódoló mecA homológot, amely keresztreagál a PBP2a latex agglutinációs teszttel, de nem ad meticillinrezisztenciát. Egy teljesen független fehérjével való antigén mimikri is lehetséges. Mindkét esetben reméljük, hogy felhívjuk a mikrobiológiai közösség figyelmét arra, hogy léteznek olyan klinikai izolátumok, amelyek megkérdőjelezhetik a PBP2a latex agglutinációs teszt specificitását.

Végeredményben először számolunk be a S. intermedius két törzsének hamis pozitív PBP2a eredményéről, amely a fenotípusos tesztek értelmezésében elkövetett kezdeti hibával együtt MRSA-ként való téves azonosításhoz vezetett. A hamis pozitív PBP2a eredmények téves fertőzésellenőrzési kísérletekhez, az antibiotikumok, például a vancomycin szükségtelen alkalmazásához és a kórházi kiadások általános növekedéséhez vezethetnek (20). Ezek az esetek aláhúzzák annak fontosságát, hogy a jelentési hibák elkerülése érdekében aktívan utánajárjunk az eltérő laboratóriumi vizsgálati eredményeknek. A koaguláz-pozitív staphylococcusok pontos fajazonosítása elengedhetetlen a klinikai izolátumok patogenitásának, klinikai jelentőségének, érzékenységi mintázatának és epidemiológiájának meghatározásához.