Az Exiguobacterium sp. 12/1 által termelt szerves sav hasznossága lúgos szennyvíz semlegesítésében
Abstract
A tanulmány célja az Exiguobacterium sp. 12/1 törzs (DSM 21148) által termelt szerves savak szerepének vizsgálata volt az italiparból származó lúgos szennyvíz semlegesítésében. Ez a baktériumról ismert, hogy képes akár 12,0 pH-jú közegben is növekedni, és képes semlegesíteni a lúgos ipari szennyvizet pH 12,0 és pH 7,5 között. A közegben jelen lévő funkciós csoportok típusának FT-IR spektroszkópiával végzett kezdeti vizsgálata a karbonil- és hidroxilcsoportnak megfelelő csúcsok jelenlétét mutatta ki, ami karbonsav vagy kapcsolódó metabolikus termék(ek) felszabadulására utal. A specifikus karboxilcsoport RP-HPLC-vel végzett azonosítása egyetlen csúcs jelenlétét mutatta ki a tenyésztési felülúszóban, amelynek retenciós ideje leginkább a hangyasavéhoz hasonlít. A különböző szénforrásokon termelt sav koncentrációját az idő függvényében vizsgáltuk. Bár a sav azonos végső koncentrációban volt jelen, a savtermelés mértéke a szacharózzal kiegészített táptalaj esetében volt a legmagasabb, amelyet a fruktóz és a glükóz követett. A baktérium anyagcsere-termékeinek megismerése az első lépésnek tekinthető az italgyártásból származó lúgos szennyvizek nagyüzemi bioremediációjában rejlő potenciáljának megvalósítása felé.
1. Bevezetés
Az alkalifilok – olyan mikroorganizmusok, amelyek pH optimuma a 9-es pH-n vagy annál magasabb pH-n növekednek – nagy hatást gyakoroltak az ipari alkalmazásokban. A biológiai mosószerek olyan enzimeket tartalmaznak, mint a lúgos cellulázok és/vagy lúgos proteázok, amelyeket alkalifilokból állítottak elő . Az alkalifileket olyan enzimek ipari előállítására is felhasználták, amelyek specifikusan felhasználhatók, például a ciklodextrint a lúgos ciklomaltodextrin-glükanotranszferáz és a lúgos aktív malthexaóz-képző α-amiláz segítségével, amelyek az élelmiszer-, vegyi- és gyógyszeriparban találnak alkalmazást. Arról számoltak be, hogy a lúggal kezelt fapép biológiailag fehéríthető az alkalifilok által termelt xilanázok segítségével. Fujiwara és munkatársai beszámoltak egy lúgos proteáz alkalmazásáról a röntgenfilmek zselatinos bevonatának lebontására, amelyből ezüstöt nyertek vissza. Az alkalifilok bebizonyították a különböző szerves vegyületek biodegradációjában rejlő potenciáljukat is .
Az alkalifil baktériumok tehát nagy érdeklődést keltettek extracelluláris enzimeik és biokémiai tulajdonságaik, mint például az alkalifil és a lúgstabilitás miatt. Bioenergetikájukat is részletesen vizsgálták , míg fiziológiájukról, például intracelluláris enzimjeikről és metabolitjaikról keveset tudunk. A köztes anyagcserefolyamatok jellemzői fontosak, mivel segítenek a baktérium jellemzésében, az enzimösszetételében, a sejtek anyagcsere-fázisában és a metabolikus mérnöki munka lehetőségeiben. A szénhidráttartalmú közeg pH-jának erős ingadozására való képességét a korábbi munkában az italiparból származó erősen lúgos szennyvíz semlegesítésére használták ki az Exiguobacterium sp. 12/1 törzs segítségével. Az Exiguobacterium nemzetség a Bacillales rendbe tartozik, amely a Bacillus nemzetség tagjait is magában foglalja. Az Exiguobacterium sp. 12/1 fakultatív alkalifil, amely optimálisan pH 10-nél növekszik, és képes semlegesíteni a lúgos szennyvizet, hogy azt pH 12,0-ról pH 7,5-re csökkentse. Feltételezhető, hogy a baktérium valamilyen savas anyagcsereterméket bocsát ki az erősen lúgos külső közeg semlegesítése érdekében. Fontos azonban jellemezni az extracelluláris közegbe kibocsátott metabolitok típusát. Itt a szerves savak termelését, mint a lúgos semlegesítés lehetséges mechanizmusát vizsgáljuk. Ilyen típusú vizsgálatokra lesz szükség, mielőtt a baktérium nagyszabású alkalmazása az italgyártásból származó lúgos szennyvíz semlegesítésére fejleszthető lenne.
Az üdítőital-ipari szennyvíz fő szénforrása a szacharóz (glükózt és fruktózt tartalmazó diszacharid), amely egyben a biokémiai oxigénigény (BOD) fő tényezője is. Az üdítőital-ipari szennyvíz átlagos BOD értéke 600 és 4500 mg/l között mozog, ami 673-5052 ppm szacharóznak felel meg. Az egyszerű cukrokon növekvő nagyszámú baktérium anyagcseretermékeinek irodalmi áttekintése arra utal, hogy a baktériumok ezeket az egyszerű cukrokat szerves savak előállítására használhatják fel. Ezt más alkalifil Bacillus fajok extracelluláris anyagcseretermékeinek elemzése is alátámasztja. Ezekben a vizsgálatokban a szacharóz szénforráson termelt fő szerves savnak az ecetsavat találták. A hangyasav a neutrofil baktériumok gyakori metabolitja anaerob körülmények között, míg a B. circulans var. alkalophilus akár 2 g/l-t is termel belőle aerob kultúrákban. Más illékony savak, mint a propionsav, vajsav, izobajsav és izovalénsav jellemzőek a Bacillus alcalophilus ssp. halodurans, B. alcalophilus és Bacillus sp. 17-1 törzsekre. Izobutirinsav és izovaleriánsav előfordulását több neutrofil bacilus táptalajában is jelentették. Ezeket a savakat, valamint a propion- és vajsavat azonban a Clostridium sp. vizsgálatai alapján aminosavakból származónak tekintik. A tejsavat és a piroszőlősavat meglehetősen gyakran termelik a neutrofil bacilusok , de a Bacillus által termelt borostyánkősav ritka . Etanolt nem mutattak ki alkalifil bacilusokban, bár ez számos neutrofil bacilus glükózkultúrájának tipikus terméke. Így a lúgos növekedési körülmények befolyásolhatják a semleges metabolitok termelését . Ebben a tanulmányban fordított fázisú nagyteljesítményű folyadékkromatográfiát használtunk az Exiguobacterium sp. 12/1 törzs által termelt savak típusának és koncentrációjának tanulmányozására a különböző típusú szénforrásokat tartalmazó magas pH-jú közeg semlegesítése során.
2. Anyagok és módszerek
2.1 . Törzs és tenyésztési körülmények
Az Exiguobacterium sp. 12/1 kultúrát a DSMZ-től szereztük be (DSM 21148), és glicerin-készletként tartottuk fenn. A 12/1 törzs rutinszerű tenyésztéséhez 37°C-on lúgos alapközeget (ABM) használtunk, amely a következőket tartalmazta (minden koncentráció g/l-ben): pepton, 1; élesztőkivonat, 0,5; glükóz, 1; K2HPO4, 0,1; Na2CO3, 1; pH 10 (az utolsó három komponenst külön sterilizált oldatokból adtuk az autoklávozott közeghez). Az IR- és RP-HPLC-analízishez a baktériumot 37°C-on, 200 rpm-en termesztettük minimális sóközegben (MSM), amely tartalmazott (minden koncentráció mM-ben): K2HPO4, 10; KH2PO4, 10; MgSO4-7H2O, 1; EDTA dinátrium só, 0,3; ZnSO4-7H2O, 0,01; MnSO4, 0,02; CuSO4-5H2O, 0,004; FeSO4-7H2O, 0,1; NaMoO4-2H2O, 0.004; (NH4)2SO4, 5 és 1% (w/v) a következő szénhidrátok valamelyikéből: glükóz, fruktóz vagy szacharóz (minden komponens külön autoklávozott tömény törzsoldatokból adva). A táptalaj végső pH-értékét 1 N NaOH segítségével 10,5-re állítottuk be.
2.2. A növekedés és a tenyésztési pH elemzése
1 ml ABM-en lévő log-fázisú tenyészet beoltására használtunk prekultúrákat (50 ml) (1% cukrot tartalmazó MSM). A tényleges tesztkultúrát (250 mL MSM 500 mL Erlenmeyer-lombikban) a teljes prekultúrával beoltottuk a log fázis közepén (O.D. ~ 1,2). Minden tenyésztési készlet három lombikból állt. A minták 650 nm-en mért abszorbanciáját használtuk a baktériumok növekedésének mérésére. A pH-t szobahőmérsékleten, 4000 × g 20 percig tartó centrifugálást követően határoztuk meg a sejtmentes tenyésztési mintákban.
2.3. FT-IR elemzés
A kultúrát 60 óra növekedés után szedtük le, és 4000 ×g-nél 20 percig centrifugáltuk. Az IR-analízishez a tenyészet felülúszót fagyasztva szárítottuk és por alakúra zúztuk. A porított felülúszót ezután kálium-bromiddal kevertük össze, majd a keveréket tablettává préseltük. Végül a tablettát FT/IR-4200 spektrométerrel (JASCO, Tokió, Japán) elemeztük.
2.4. RP-HPLC analízis
A kultúrát különböző időpontokban szedtük le, és 4000 × g-n 20 percig centrifugáltuk. A HPLC-analízishez a tenyészet felülúszóját 0,22 μm-es szűrőn keresztül szűrtük, és 10 μL szűrt mintát injektáltunk a HPLC-oszlopba.
Az analitikus standard minőségű hangyasavat, ecetsavat, borostyánkősavat, propionsavat, tejsavat és izobajonsavat a Sigmától szereztük be. Standard törzsoldatokat (100 mg/ml vagy 100 μl/ml) készítettünk, amelyeket 4°C-on tároltunk a további felhasználásig. A standard munkaoldatokat (10 mg/ml vagy 10 μL/ml) naponta készítettük. Milli-Q vizet (Millipore) használtunk az egyes vegyületek és minták puffer- és törzsoldatainak elkészítéséhez. A törzsoldatokat, a mintákat és a puffereket Whatman cellulózmembrán szűrőkön (0,45 μm, Whatman, Clifton, NJ, USA) szűrtük. Az oldószereket felhasználás előtt vákuumban gáztalanítottuk.
A szerves savak analízisét Tormo és Izco módszere szerint végeztük. Az analízist Breeze System (Waters, Mildford, MA, USA) berendezésen végeztük, amely egy 1525 bináris HPLC szivattyúból, egy 717 plus autosamplerből és egy 2487 kétcsatornás, 210 nm-re beállított UV detektorból állt, és Breeze szoftverrel működött. Az elválasztást egy 250 × 4,6 × 5 μm-es Atlantis dC18 oszlopon (Waters) végeztük. Naponta 20 mM foszforsavval pH 2,20-ra beállított NaH2PO4-et készítettünk, amelyet 0,2 μm-es hidrofil membránon (Millipore) keresztül szűrtünk. Az oldószerprogram két tartályt használt, amelyek 1% acetonitrilt tartalmaztak 20 mM foszforsavval pH 2,20-ra beállított 20 mM foszfátpufferben (Solvent A) és acetonitrilt (Solvent B); az áramlási sebességet 1,5 ml/percben állítottuk be szobahőmérsékleten. A gradiens program 100%-os A oldószerrel kezdődött, majd 7 perc után a B oldószert lineárisan növeltük, hogy 5 perc alatt elérjük a 7%-ot. 12-től 19 percig a sebességet az A oldószer 93%-án és a B oldószer 7%-án tartottuk. Ezt követően a sebességet a kiindulási körülményekre változtattuk, hogy az oszlop 15 percig egyensúlyban legyen, mielőtt a következő mintából ismét 10 μL-t injektáltunk.
3. Eredmények
3.1. Eredmények
3.1. Az eredmények. A semlegesítés elemzése meghatározott közegen
A baktérium által termelt szerves sav elemzéséhez minimális sós közeget választottunk, mivel az meghatározott jellegű és az italipari szennyvízhez hasonló szénforrás. A baktériumot különböző szénforrásokkal, glükózzal, fruktózzal és szacharózzal kiegészített minimális sós táptalajon hagytuk növekedni. Az 1. ábra a táptalaj növekedési profilját és pH-jellemzőit mutatja az idő függvényében. A fruktóz és a szacharóz a glükózhoz képest sokkal gyorsabban semlegesítette a közeget. A glükózzal kapott végső pH is valamivel magasabb volt, mint a szacharózzal és fruktózzal kiegészített közeg esetében. Ez tükröződik a három szénforráson termesztett baktérium növekedési profiljában is. A baktériumok gyorsabban növekedtek a szacharózban, majd a fruktózban és a glükózban.
(a)
(b)
(a)
(b)
Változás a pH (a) és az O.D. (b) változása az MSM-en az idő függvényében. Az értékek három ismétlődő mérés átlagát, a hibasávok pedig a szórást jelölik.
3.2. A tenyésztési felülúszóban jelen lévő funkcionális csoport azonosítása
A baktérium által a lúgos szennyvíz semlegesítése érdekében termelt metabolit széles funkcionális csoportjának azonosítása érdekében a fagyasztva szárított tenyésztési felülúszót FT-IR spektroszkópiának vetettük alá. A spektrumban két, a karbonilcsoportnak (1644,98 cm-1-nél) és a hidroxilcsoportnak (3436,74 cm-1-nél) megfelelő csúcs volt jelen (1. táblázat). Az irodalmi áttekintés szerint a baktérium valószínűleg szerves savakat termel metabolikus termékként, amelyek semlegesítik a lúgos szennyvizet.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3.3. táblázat. A baktérium specifikus anyagcseretermékének azonosítása
A baktérium által termelt szerves sav azonosítása érdekében fordított fázisú HPLC-t végeztünk irodalmi áttekintés alapján kiválasztott ismert szerves sav standardok felhasználásával. A standardokat egyenként (2. ábra (a)) és keverékben (2. ábra (b)) is futtattuk annak érdekében, hogy megállapítsuk a közegben lévő egyéb szerves savak interferenciájából adódó esetleges retenciós időbeli különbségeket. A standard szerves savak RT-je a két esetben hasonlónak bizonyult, a retenciós időbeli különbség nem haladta meg a 0,09 egységet, kivéve a propionsavat (2. táblázat). A tenyésztési felülúszót ugyanezzel a módszerrel elemezték, és egyetlen csúcsot találtak, amely a hangyasavhoz hasonló retenciós idővel rendelkezett. Ezt tovább erősítettük, amikor a felülúszót standard hangyasavval spicceltük, amelynek csúcsa szuperponált a felülúszóban lévő termékével (2. ábra d)).
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
RP-Az egyes standard szerves savak HPLC-kromatogramjai (a), standard szerves savak keverékben (b), tenyésztési felülúszó (c) és hangyasavval spiccelt tenyésztési felülúszó.
3.4. A baktérium metabolikus termékének mennyiségi elemzése
A tenyésztési felülúszó mennyiségi elemzéséhez a hangyasav különböző standardkoncentrációit futtattuk, és kiszámítottuk az egyes koncentrációknak megfelelő csúcsterületet. A csúcsterületet a koncentráció függvényében ábrázoltuk, hogy standard görbét kapjunk (3. ábra). Ezt a standardgörbét használtuk a különböző szénforrásokkal kiegészített minimális sós táptalajon az idő függvényében termelt sav mennyiségének kiszámítására. A baktérium tenyésztési felülúszóját időfüggő módon elemeztük, és ismét fordított fázisú HPLC-analízisnek vetettük alá. Megállapítottuk, hogy a baktériumtenyészet felülúszójában a fő termék csúcsa az idővel növekszik. A sav retenciós ideje hasonló a hangyasavéhoz. A különböző szénforrásokkal előállított hangyasav vizsgálata az idő függvényében a 4. ábrán látható. A legnagyobb mennyiségű sav a szacharózzal kiegészített MSM esetében keletkezett, amelyet a fruktóz és a glükóz követett.
Standard görbe a hangyasav koncentrációjának meghatározására a tenyésztési felülúszóban.
A termelt szerves sav mennyiségének időbeli változása különböző szénforrásokkal kiegészített MSM-en. Az értékek három ismétlődő mérés átlagát, a hibasávok pedig a szórást jelölik.
4. Megbeszélés
A fő szénforrás az italipari szennyvíz elfolyójában a szacharóz . Ezért a semlegesítés során keletkező anyagcseretermék elemzéséhez egy jól definiált, szacharózt és a két alkotó monoszacharid cukrot – glükózt és fruktózt – tartalmazó minimális sóközeget választottunk. A 12/1 törzs növekedési jellemzői a három szénforrással kiegészített minimális sós táptalajon a növekedéssel egyidejűleg hatékony semlegesítést mutatnak (1. a) és 1. b) ábra). A növekedési közeg pH-értékének csökkenése szükségszerűen vagy a savak képződésének, vagy a bázisok eltávolításának köszönhető .
A savak termelődése jól dokumentált az egyszerű cukrokon tenyésztett baktériumok esetében. A Bacillus nemzetség egyes alkalifil tagjainak anyagcsere-termékeit tanulmányozták . Ezekben a vizsgálatokban a szacharóz szénforráson termelt fő szerves savnak az ecetsavat találták. Az alkalifil bacillus fajok – Bacillus pseudofirmus OF4, Bacillus halodurans és Bacillus clausii – genomszekvenciái szintén alátámasztják ezt a megfigyelést, mivel ezek a fajok mindegyike rendelkezik funkcionális piruvát-acetát átalakítási úttal. A hangyasav a neutrofil baktériumok gyakori metabolitja anaerob körülmények között, míg a B. circulans var. alkalophilus akár 2 g/l-t is termel belőle aerob kultúrákban. Más illékony savak, mint a propionsav, vajsav, izobajsav és izovalénsav jellemzőek a Bacillus alcalophilus ssp. halodurans, B. alcalophilus és Bacillus sp. 17-1 törzsekre. Az izobutirinsav és izovaleriánsav több neutrofil bacilus táptalajában is előfordult . Ezeket a savakat, valamint a propion- és vajsavat azonban a Clostridium sp. vizsgálatai alapján aminosavakból származónak tekintik. A tejsavat és a piroszőlősavat meglehetősen gyakran termelik a neutrofil bacilusok , de a Bacillus által termelt borostyánkősav ritka . Etanolt nem mutattak ki alkalifil bacilusokban, bár ez számos neutrofil bacilus glükózkultúrájának tipikus terméke. Így a lúgos növekedési körülmények befolyásolhatják a semleges metabolitok termelését .
A bacillus sp. esetében a metabolikus termékekkel kapcsolatos kezdeti vizsgálatokat titrimetriás eljárással végezték . A baktériumtenyészet felülúszójának megnövekedett pufferkapacitását pH 5 körül, ami a karbonsavak protonálódásának tipikus tartománya, arra a feltételezésre használták, hogy a közeg karbonsavakat tartalmaz. Ebben a tanulmányban FT-IR spektroszkópiát használtunk a tenyésztési felülúszóban jelen lévő vegyület(ek) funkcionális csoportjának megállapítására. Az FT-IR spektrográf a karbonilcsoportra (1644,98 nm-en) és a hidroxilcsoportra (3436,74 nm-en) jellemző csúcsokat mutatott (1. táblázat), ami egy hidroxil- és karbonilcsoportból álló kémiai faj jelenlétére utal, és nagy valószínűséggel karbonsav lehet.
A tenyésztési felülúszóban jelen lévő szerves savak elemzésére fordított fázisú HPLC módszert használtunk. A HPLC körülményeket a legjobbnak ítélt felbontáshoz választottuk, azaz pH 2,2 és 1%-os acetonitril. A fordított fázisú HPLC módszer előnyös az olcsóbb oszlopok használata, az analitikai paraméterek könnyebb manipulálása az elválasztás optimalizálása érdekében, valamint a szobahőmérsékleten végzett elemzések miatt . A módszert először az irodalmi áttekintés alapján kiválasztott savstandardok retenciós idejének kiszámítására használtuk. A savak elúciós sorrendje ezen körülmények között megegyezett a Tormo és Izco tanulmányban leírtakkal, de az ebben a tanulmányban megfigyelt és a Tormo és Izco tanulmányban leírt retenciós idők között eltérés volt. Ez az eltérés a HPLC körülményeinek különbségére vezethető vissza, mint például a 25-30°C-os hőmérséklet ebben a vizsgálatban a Tormo és Iczo által közölt 24°C ± 1°C-kal szemben.
A tenyésztési felülúszó RP-HPLC-je egyetlen csúcs jelenlétét mutatja, amelynek abszorbanciája 211 nm-nél van, ami a szerves savak jellegzetes abszorpciós hullámhossza. Így a felülúszó egyetlen kémiai fajt tartalmaz, amely valószínűleg szerves sav. E csúcs retenciós idejének és a standard szerves savak retenciós idejének összehasonlítása azt mutatja, hogy a retenciós idő leginkább a hangyasavhoz hasonlít. Ezt a megfigyelést tovább erősítette a hangyasavnak a tenyésztési felülúszóba történő bejuttatása, ami növeli a termék csúcsterületét (2.c) és 2.d) ábra). A hangyasav jelenléte a tenyésztési felülúszóban összhangban van a Bacillus nemzetség néhány alkalifil tagja, valamint néhány szacharolitikus anaerob alkalifil baktérium, például a Halonatronum saccharophilum, Amphibacillus fermentum és Amphibacillus tropicus metabolikus termékeivel.
Az alkalifil baktériumoknál eddig jelentett maximális időegységenkénti pH-egység csökkenés 0,13 egység óránként a Bacillus circulans var. alkalophilus esetében, ami meglehetősen alacsony az ebben a vizsgálatban jelentett több mint két egységnyi csökkenéshez képest a beoltás kezdeti 1 órája alatt. A pH nagymértékű csökkenése savas katabolikus termékek képződésére utal. A pH csökkenésének mértéke önmagában azonban nem jelzi a savak koncentrációjának növekedését . Ezért a baktérium metabolikus termékének mennyiségi elemzését RP-HPLC segítségével végeztük el. A HPLC-t részesítettük előnyben a GC-vel szemben, mivel az alkalofil baktériumok tenyésztési felülúszójában lévő szerves savak meghatározására szolgáló GC és HPLC módszerek összehasonlítása azt mutatja, hogy míg a savak felbontása GLC-vel kiváló volt, a mennyiségi reprodukálhatóság HPLC-vel jobb volt, mint GLC-vel . A várakozásoknak megfelelően a termelt sav koncentrációja az inkubációs idő növekedésével nőtt (4. ábra). Valójában a sav mennyisége a minimális pH elérése után is tovább nőtt. Ez összhangban van a fakultatív és obligát alkalifil Bacillus sp. savtermelésének korábbi vizsgálataival, ahol a savtermelés még 30 órával a minimális pH elérése után is tovább nőtt. A különböző szénforrásokkal kiegészített közegekben termelt metabolikus termék összehasonlító elemzése azt mutatja, hogy bár a sav azonos végső koncentrációban volt jelen, a savtermelés mértéke a szacharózzal kiegészített közegben volt a legmagasabb, amelyet a fruktóz és a glükóz követett (4. ábra). Ez összhangban van a szervezet növekedési jellemzőivel az ezekkel a cukrokkal kiegészített táptalajokon.
5. Következtetés
Az Exiguobacterium sp. 12/1 törzs a külső közeg pH-ját rövid láncú szerves sav-forminsav termelésével semlegesíti. Figyelembe véve a lúgos szennyvizek nagyüzemi bioremediációjának lehetséges alkalmazását, a baktériumnak ez a lúgsemlegesítő képessége az italipari szennyvizek esetében az első lépésnek tekinthető a kereskedelmi hasznosítási potenciál kiaknázása felé.
Köszönet
N. M. Kulshreshtha köszöni a University Grants Commission kutatási ösztöndíját. A szerzők mérhetetlenül hálásak az indiai Tudományos és Ipari Kutatási Tanácsnak, amiért K&D platformot és eszközöket biztosított ehhez a kutatáshoz.