Eredmények és vita

A KSI különböző mutált modellrendszereinek szerkezetét és energiáit vizsgáltuk három reakciólépés mentén: (ES → TS1 → EI1); másodszor, a protonált Asp-40 enyhe forgása (EI1 → TS2 → EI2); és harmadszor, proton adományozása C6-β pozícióba az Asp-40 által (EI2 → TS3 → EP), amint az az ábrán látható. 1. A WT előre jelzett energiaprofilja (2A. ábra) hasonló a Pollack és munkatársai (25) megfelelő kísérleti profiljához. Meg kell jegyezni, hogy a TS2-nél a szubsztrát részben semlegesül, mivel a katalitikus maradékok H atomjai közelednek a szubsztrátban lévő oxianion (O3) felé, és a felesleges elektron a H-kötéseken keresztül átkerül a szubsztrátból a szomszédos katalitikus maradékokra. Így a szubsztrát, a Tyr-16/57 és az Asp-103 egy negatív töltésegységen osztozik, és töltéseloszlásuk a mutánsok katalitikus maradékainak protonaffinitásától és elektronaffinitásától függ. Ez a TS2 állapot katalitikus maradékokkal szemben áll a katalitikus maradékok nélküli állapottal, amelyben a szubsztrát közel egy egységgel negatívan töltött.

Az általunk számított (szteroid helyett equileninnel komplexált) EI-k háromdimenziós szerkezete szinte pontosan megegyezik a PI(g′) és TI(g′) röntgenszerkezetével. A Tyr-16/57 + Asp-103 + equilenin komplex megjósolt szerkezetében a Tyr-16 és Asp-103 két távolság d(O3-Or) értéke (2,54 és 2,55 Å) jó összhangban van a röntgenadatokkal (2,6 ± 0,1 Å mindkettőre a PI esetében és 2,58 ± 0,08 Å, illetve 2,62 ± 0,07 Å a TI esetében) (32, 33, 36). Mivel a számított szerkezeteket kényszerek nélkül optimalizáltuk, a kísérleti és elméleti geometriák egyezése azt jelzi, hogy az enzimben a kulcsmaradékok közel maximális kölcsönhatást fejtenek ki a szubsztráttal feszültség nélkül.

Vélelmezték, hogy oldatban a TI aktív centrum dyadikus szerkezetű lehet (Asp-99… Tyr-14… equilenin) (29), ami eltér a TI és PI röntgenszerkezetétől (32, 33). A PI/equileninre vonatkozó legújabb NMR-kísérlet azonban azt mutatta, hogy a PI(D40N)/equileninben egy jellegzetes erős lefelé irányuló rezonancia jelenik meg 16,8 ppm-nél, és egy gyenge 13,1 ppm-nél (36), hasonlóan a TI/equilenin esetében Mildvan (29) és Pollack (25) csoportjai által vizsgált esethez. Ezt az eredményt mutatják a Tyr-16/57 + Asp-103 + equilenin komplexre végzett ab initio számításaink is, ahol a 16,5 ppm-nél lévő erős lefelé irányuló rezonancia a Tyr-16-hoz rendelhető. A kísérlet azt is mutatja, hogy a D103L + D40N mutánsban egy erős (Tyr-16-hoz rendelt) lefelé irányuló rezonancia jelenik meg, míg az Y16F + D40N mutánsban az erős rezonancia eltűnik. Ez a kísérlet tehát egyértelműen kizárja azt a dyadikus szerkezetet, amelyben az erős lefelé irányuló rezonanciát a Tyr-16-hoz H-kötéssel kapcsolódó Asp-103-hoz rendelték (36).

Az abszolút sebességállandók a számított aktivációs korlátok segítségével vizsgálhatók. A B3LYP/6-31+G* és MP2/6-31+G* szinteken a KSI WT aktivációs gátja némileg alulbecsült a Pollack és munkatársai (46) által közölt kísérleti gáthoz képest (10 és ≈11 kcal/mol). Ha azonban figyelembe vesszük a KSI dielektromos közeg hatását (31), a WT aktiválási gátja 8,2 kcal/mol, ami szoros összhangban van a kísérleti értékkel. Az enyhe, 2-3 kcal/mol-os alulbecslés egy pontosabb számítással és az aktív centrum körüli apoláris maradékokat is tartalmazó teljesebb modellrendszerrel magyarázható. Az abszolút aktivációs gátakkal ellentétben a különböző mutánsok közötti relatív aktivációs gátak és így a reakciómechanizmus a számítási szinttől függetlenül meglehetősen konzisztensek, mivel a különböző, hasonló környezettel rendelkező modellrendszerek közötti eltörlő hatás miatt. Így a különböző mutánsok közötti relatív aktivációs gátak alkalmazásával megkaptuk a relatív reaktivitást (a mutáns kinetikai sebességállandójának és a WT kinetikai sebességállandójának hányadosa) vagy log(kcat/kcat(WT)) azzal a feltételezéssel, hogy a reakcióutak mentén az ES-ről a TS1-re történő átvitel a sebességmeghatározó lépés (lásd az 1. táblázat lábjegyzetét). Az MP2 számítások megerősítik a B3LYP szinten kapott eredményeket. A log(kcat/kcat(WT)) megjósolt értékei jó összhangban vannak a PI (32-35) és TI (25-28, 31) esetében mért értékekkel (1. táblázat). Mivel a TI nagymértékben homológ háromdimenziós (tercier és kvaterner) szerkezete és aktívhelyi környezete hasonló a PI-éhez, a katalitikus reakciók a két KSI-ben várhatóan azonos módon zajlanak.

Fig. 2 mutatja az energiák és H-kötéstávolságok profiljait a különböző mutánsok számára a reakcióút mentén. A teljes energiaprofilok (ΔE) (2A ábra) közel szimmetrikusak a TS2 tekintetében. Az első és a harmadik lépés gátjai hasonlóak. A második lépés, amelynek kicsi a gátja (≈1 kcal/mol), nem lehet sebességmeghatározó, mivel a H atomnak csak egy minimális (csak néhány fokos, mert az Asp-40 erősen ferde a szubsztrát síkjával szemben) elfordulása révén történő enyhe eltolódását jelenti egy C-C kötés (vagy C-H kötés az 1. és 3. ábrán) körül. Így a reakció gyakorlatilag kétlépéses mechanizmusnak tekinthető. A maradékok az első lépést egy proton (részleges) leadásával katalizálják a szubsztrátnak (mint savnak), míg a harmadik lépést egy proton (részleges) felvétele katalizálja a szubsztráttól (mint bázis). Lásd a H-kötések oxigének közötti távolságát és a közös proton O3 és Or középpontjától való középponton kívüli távolságát, ahol a pozitív/negatív érték azt jelzi, hogy a proton a maradékok/szubsztrát közelében van.

A kisebb protonaffinitású (pA a gázfázisban vagy pKa a dielektromos közegben) savas maradékok esetében az aktivációs gát alacsonyabb lenne az első lépésnél és magasabb a harmadik lépésnél, míg a magasabb pA vagy pKa értékű bázikus maradékok ellenkező hatást váltanának ki. Következésképpen a kétlépéses enzimmechanizmusban az optimális katalitikus teljesítmény akkor érhető el, ha az enzim maradékai kettős szerepet töltenek be: nagyon erős proton donor/akceptor szerepet játszanak a szubsztrát felé/onnan felváltva (amfisav/bázis katalizátor vagy proton/elektron puffer néven) a teljes reakcióban. Az enzimek dielektromos közegében a maximális katalitikus hatás a maradékok és a szubsztrát azonos pKas értékei esetén érhető el. Ez a helyzet ellentétben áll az egylépéses reakciókkal, ahol a nagy pKa-különbség fokozza a reakcióképességet (47, 48). A maradékok és a szubsztrát közötti egyenlő pKa feltétele a maximális katalitikus hatáshoz megfelel annak a követelménynek, hogy az enzim maradékainak a szubsztráttal azonos pKával kell rendelkezniük a maximális SSHB-k kialakításához (4-7, 15, 23, 24). Így a KSI kétlépcsős reakciómechanizmusában az SSHB-k mint amfisav/báziskatalizátorok a részleges protontranszportokkal és töltésátcsoportosításokkal együtt döntő szerepet játszanak az EI-k erős stabilizálásában ≈15 kcal/mol a maradékok által vezérelt stabilizációs energiában és a reakcióút-függő interoxigén távolság-rövidülésben az ES állapothoz képest .

A maradék által vezérelt stabilizációs energia ΔΔEa bizonyos mértékig korrelál a ΔdES-sel, kivéve, ha a protonátvitel a maradékból a szubsztrátba történik (azaz, hacsak a ΔrH nem negatív tartományban van a 2C. ábrán). Ezért az EIs és TSs stabilizáció az ES állapothoz képest a H-kötés távolságának, és így a H-kötés erősségének rövidülésével hozható összefüggésbe. Vagyis a normál (vagy közönséges) H-kötések (semleges partnerek között) az ES-állapotban inkább SSHB-kké válnak (ionos fajokat bevonva) az EIs és TS2 állapotokban. Így ezeknek a rövid kötéseknek kell felelősnek lenniük a maradékok által vezérelt energiacsökkenés egy részéért. Ami a protonátvitelt illeti, a potenciál az ES-nél minden mutáns esetében egyetlen kút, míg a potenciál alakja (az EI-k vagy TS-ek közelében) abban a régióban, ahol ΔrH közel nulla (azaz a TS1/EI1 körül a c és az EI1/TS2 körül az e és f esetében a 2C. ábrán) a kettős kút bizonyos jellemzőit hordozza. ΔrH kis abszolút értéke (<≈0,5 Å) esetén (2C. ábra) a protonátvitel gátja számításaink szerint nagyon kicsi, így a kettős kút típusú potenciálban történő protonátvitel önmagában nem magyarázza az aktivációs gát drasztikus csökkenését. Valóban, a g. eset, amelyben a potenciál kettős kagylószerű jellemzői szinte eltűnnek a kevés protonátvitel mellett, nagyobb energiacsökkenést mutat, mint az f. eset, amelyben a protonátvitel kettős kagylószerű potenciálban történik. Másrészt a 2. D és E ábrán meg kell jegyezni, hogy a protonátadások után a ΔdES már nem rövidül, hanem kissé meghosszabbodik, míg a ΔΔEa továbbra is csökken. Így a H-kötés hosszának rövidülése önmagában (azaz ΔdES) nem magyarázza a TS-eknél és EI-knél bekövetkező drasztikus gátcsökkenést (azaz ΔΔEa). Így a TS-eknél és az EI-knél bekövetkező gátcsökkenést további kölcsönhatási erőkkel kell magyarázni, amelyeket a szubsztrátok és a maradékok közötti molekuláris orbitális (MO) kölcsönhatások szempontjából tárgyalunk (a töltéstranszfer által kiváltott elektronikus átrendeződések vagy töltésátrendeződések révén).

Két konkurens maradék esetén, mint az f és g esetben, az EI-k/TS-ek kumulatív stabilizációja fokozottabb kcat-t eredményez. Ez a hatás azonban némileg szubadditív (azaz kisebb, mint az egyes maradékok stabilizációs energiáinak összege), mivel a másik maradék jelenléte miatt az egyes maradékok esetében az oxianion protonelvonó ereje csökken. Ez a szubadditivitás azt jelzi, hogy az SSHB-k töltésátvitelt és polarizációt (azaz indukált elektrosztatikus kölcsönhatásokat) és esetleg részleges kovalens kötést foglalnának magukban. Valóban, az EI-k és TS-ek stabilizálódása katalitikus maradékok jelenlétében elsősorban az aktív centrumban jelen lévő felesleges elektron delokalizációjából származik töltésátvitel és polarizáció révén, amit alább látni fogunk. A szubsztrát hatékony természetes kötésorbitális-populációs töltései (49) az a, c-e és f esetekben a TS1-nél -0,57, ≈-0,43 és -0,37 értékek. Így a szubsztrát negatív töltése két katalitikus maradék jelenlétében jobban csökken. Ez a csökkenés abból adódik, hogy a felesleges elektron a szubsztrátból átkerül a nagy elektronaffinitású katalitikus maradékokra, amelyek puffer szerepet játszanak a felesleges elektron számára. Bár az Asp erősebb elektronelvonó képességgel rendelkezik, mint a Tyr, a Tyr elektronaffinitása alacsonyabb, mint az Asp-é. Így a Tyr ugyanolyan hatékonyan, vagy valamivel hatékonyabban csökkenti az aktivációs gátat, mint az Asp. A TS-ek és EI-k stabilizálódása katalitikus maradékok jelenlétében nagymértékben korrelál a felesleges elektron állapot energiájának csökkenésével , mivel a felesleges elektron befogadására szolgáló tér a katalitikus maradékokkal a szubsztrát mellett megnő. Ez az energiacsökkenés közvetlenül összefügg a bizonytalansági elvvel; minél kevésbé lokalizált a felesleges elektron, annál jobban stabilizálódik.

A számított kémiai eltolódások (δ) némileg korrelálnak a d(O3-Or) legkisebb értékével azonos számú H-kötés esetén , míg a második H-kötés jelenléte növeli a δ-t a fokozott szűrőhatás miatt. Eredményeink alapján a δ nagy értéke gyakran jó indikátora lehet az SSHB-nek, de a δ csak részben korrelál a kcat értékkel. Ez a korreláció különösen nagy δ (>16 ppm) vagy kis ΔrH abszolút érték (<0,5 Å) esetén csökken, mivel a kcat δ-től való függését megkérdőjelezték (50).

Az aktivációs korlátok csökkenése katalitikus maradékok jelenlétében jól érthető a MO analízisből (3. ábra). A TS2 MO energiaszintek feltűnő különbsége a és g között a szubsztráton az Asp-40 által végzett deprotonálással felhalmozott többlet elektronsűrűség kvantum jellegéből adódik. Az elektronsűrűség egy részének a katalitikus maradékok felé történő disszipálásával elért stabilizáció a korábban említett bizonytalansági elvnek köszönhető, ami hasonló ahhoz, amit a vízklaszterekkel kölcsönhatásba lépő felesleges elektron esetén megfigyelhetünk (51, 52), ami az ésszerűen nagy üregtér mellett szól. Így a katalitikus maradékok jelenléte (amelyek a szubsztrátról a katalitikus maradékokra történő részleges elektrontranszfer révén töltéspufferelő szerepet játszanak) drasztikusan csökkenti az oxianionon felhalmozódó töltést. Az EI-k és TS-ek ezen stabilizációját lényegében az SSHB-k segítik. Ez a hatás nagymértékben fokozódik mind az Asp-103, mind a Tyr-16/57 jelenlétében. A g eset MO energiái így jóval alacsonyabbak, mint az a esetben. Az enzim dielektromos közeghatása nem olyan drasztikus, mint az elektronátvitellel járó katalitikus maradék hatása. Így az SSHB-k által elősegített részleges proton transzferek és töltés redisztribúciók jobban felelősek a TS-ek és EI-k csökkenéséért, mint az enzim dielektromos hatása. Következésképpen a katalitikus hatás a nem indukált elektrosztatikus energiákból és a MO kölcsönhatási energiákból (polarizáció, töltésátvitel és kovalens kötési energia) származó nyereségek kedvező kombinációjából adódik. Míg az előbbi a töltött H-kötések jelenlétéből adódó (és így az SSHB-k erősségével összefüggő) részleges proton-transzportokból adódik, addig az utóbbi elsősorban a katalitikus maradékok miatti elektron delokalizációból adódik, amelyek puffer-szerepet játszanak egy-egy felesleges elektron számára. Az MO kölcsönhatás energiájának növekedése szorosan összefügg az SSHB által elősegített további enzim-szubsztrát kölcsönhatással.

A stabilizációs energia így az EIs/TSs töltött H-kötés (ionos fajokat érintő) energiájának az ES normál (semleges partnerek közötti) H-kötéséhez viszonyított megnövekedett energiájának és az elektronok katalitikus maradékok felé történő disszipációjával járó töltésátrendeződések miatti MO kölcsönhatás energiájának növekedésének összegeként ábrázolható. Mivel a két energiatényező nem könnyen szétválasztható, nehéz megbecsülni az egyes tényezőket. A d esetben azonban a következő módszerrel értékeljük ki ezeket a kifejezéseket. Az EI1 ES-hez viszonyított energiáinak összehasonlításából a Tyr-16 (Y16) hiányában és jelenlétében az EI1 Y16 általi stabilizációs energiája 8,7 kcal/mol. Annak vizsgálatára, hogy a nem indukált elektrosztatikus kölcsönhatás (amely nem tartalmazza a szubsztrát + Asp-40 (D40) Y16 maradékra gyakorolt elektrosztatikus indukciós hatását) milyen mértékben járul hozzá a stabilizációhoz, elvégeztük az ES és az EI1 számításait abban az esetben, amikor az Y16-ot egy csak a természetes kötéspálya (NBO) töltéseiből álló szellemmaradék (Y16q) helyettesíti, amelyeket egyetlen molekula Y16-ra számítottunk szubsztrát + D40 hiányában. Ekkor a nem indukált elektrosztatikus kölcsönhatási energia nyereség (vagy az előszerveződés által vezérelt elektrosztatikus energia nyereség) 4,4 kcal/mol, ami a töltött H-kötés (azaz maga az SSHB) fokozott kötéserősségéért felelős. Ezután a stabilizációs energiák különbségének az Y16 általi teljes kvantumhatás és az Y16q által nem indukált elektrosztatikus hatás (4,3 kcal/mol) között az indukált elektrosztatikus kölcsönhatási energiából, kovalens energiából stb. kell származnia. Az indukált elektrosztatikus kölcsönhatás magában foglalja a polarizációs és töltésátadási hatásokat. Az indukált elektrosztatikus energia nyereségének meghatározásához először megkaptuk az Y16 atomtöltését (Y16qind), amely tartalmazza az indukciós hatást a szubsztrát + D40 jelenlétében. Ezután elvégeztük az ES és az EI1 számításait abban az esetben, amikor az Y16-ot egy csak annak atomos ponttöltéseiből álló szellem-maradékkal (Y16qind) helyettesítjük. Mivel ez a stabilizációs energia 8,2 kcal/mol, a szubsztrát + D40 és Y16 közötti kölcsönhatásból eredő indukált elektrosztatikus energiamennyiség 3,8 kcal/mol. Így a töltésátvitel és a polarizáció okozta energianyereség nagy, és összehasonlítható a nem indukált elektrosztatikus energianyereséggel. Az Y16 maradék fontos katalitikus szerepet töltéspufferként játszik a szubsztrátban lévő felesleges negatív töltés nagy részének visszavonásában és megtartásában, valamint a reakció során a megfelelő elektronikus töltésátrendeződésben. Ez az indukált elektrosztatikus energia a MO kölcsönhatási energiából keletkezik a katalitikus maradék (Y16) és a szubsztrát + D40 közötti kvantummechanikai elektronikus töltéskölcsönhatás révén (azaz az SSHB által vezérelt szubsztrát-maradék kölcsönhatási energia). Végül a fennmaradó 0,5 (= 8,7 – 8,2) kcal/mol energia-hozzájárulás nagyrészt a nem elektrosztatikus kovalens energiának felelhet meg. Ez az energia meglehetősen kicsi, amit MO-elemzésünk is alátámaszt, miszerint magában az SSHB-ben a nem-elektrosztatikus orbitális átfedés nem jelentős.

A kétlépéses reakciómechanizmussal járó enzimekben a szubsztrát nem teljesen negatív töltésű, hanem részben anionos, a katalitikus maradékok felé történő elektronleadással. Így ebben az esetben az SSHB által vezérelt stabilizációs energia növekedés (≈10 kcal/mol az EI1-nél) a normál H kötéshez képest nem bizonyul kicsinek . Ha az SSHB energiát kiterjesztjük a szubsztrát-maradék kölcsönhatásokra a szubsztrát és a maradék töltésátrendeződések miatt, akkor a stabilizációs energia az előszerveződés által vezérelt SSHB energia és az SSHB által vezérelt MO kölcsönhatási energia összege. Ha azonban csak magának az SSHB-nek az erősségét vesszük figyelembe, a kötési energia növekménye jóval kisebb (≈5 kcal/mol-ra).