I. típusú izoenzim

Amint az 1. ábrán látható, a hexokináz a kapuként szolgál, amelyen keresztül a Glc belép az alternatív metabolikus útvonalakba. Ennek ellenére valószínűleg nyugodtan mondhatjuk, hogy a hexokinázra leginkább glikolitikus enzimként gondolnak, és a glikolitikus anyagcserét általában citoplazmatikus folyamatnak tekintik. Ezért volt figyelemre méltó, hogy más glikolitikus enzimektől eltérően a hexokináz aktivitást (ma már az I. típusú izoenzimként ismert) túlnyomórészt az agyhomogenátumok “részecskefrakcióiban” találták (Crane és Sols,1953). Későbbi munkák (Johnson, 1960;Rose és Warms, 1967; lásd mégWilson, 1995) kimutatták, hogy a partikuláris hexokináz a mitokondriumokhoz, pontosabban a külső mitokondriális membránhoz kapcsolódik (Rose és Warms, 1967;Kropp és Wilson, 1970).A kötődés döntően egy hidrofób N-terminális szekvenciától függ (Polakis és Wilson, 1985)amely szelektíven a mitokondriumokhoz irányítja az I. típusú izoenzimet (Gelb és mtsai, 1992;Sui és Wilson, 1997), és a kötődés során a külső mitokondriális membrán hidrofób magjába kerül (Xie és Wilson, 1988). A porin (más néven `VDAC’, a `voltagedependent anion channel’ rövidítése) képezi azt a csatornát, amelyen keresztül a metabolitok áthaladnak a külső mitokondriális membránon, és a hexokinázzal kölcsönhatásba lépő külső mitokondriális membránfehérjeként azonosították (Felgner és mtsi., 1979;Lindén és mtsi., 1982;Fiek és mtsi., 1982). Továbbá, bizonyítékok támasztják alá azt a nézetet, hogy a hexokináz kötődése preferenciálisan a porinhoz történik, amely a kontakt helyeken található, olyan régiókban, ahol a belső és a külső mitokondriális membránok között szoros kapcsolat van(Dorbani et al., 1987;Kottke et al., (1988;BeltrandelRio és Wilson,1992a).

Johnson(1960), valamint Rose és Warms(1967) klasszikus tanulmányait hamarosan követték a mitokondriumhoz kötött hexokinázról szóló jelentések más normális szövetekből, az agy mellett különböző tumorsejtekből is (hivatkozásokért lásd Wilson, 1985,1995). Egy “glikolitikus” enzimnek a mitokondriumokkal, az oxidatív metabolizmus elsődleges helyszínével való társulásának lehetséges élettani jelentősége sok spekuláció tárgyát képezte. Már korán, és különösen azután, hogy felismerték, hogy a külső mitokondriális membrán “hexokináz-kötő fehérje” azonos a porinnal, és így a hexokináz annak a pontnak a közelében helyezkedhet el, ahol az ATP kilép a mitokondriumból (és az ADP újra belép a mitokondriumba), A spekulációk nagyrészt arra a lehetőségre összpontosítottak, hogy ez a közelség elősegítheti az intramitokondriális oxidatív foszforiláció mint az ATP szubsztrát forrása és a mitokondriálisan kötött hexokináz által végzett glc-foszforiláció közötti bensőséges metabolikus kölcsönhatást. Ezt Rose és Warms (1967) is fontolóra vette, de kísérleti eredményeik nem tudták alátámasztani. Azonban mások későbbi munkái (hivatkozásokat lásd Wilson,1985,1995), amelyekben különböző forrásokból származó mitokondriálisan kötött hexokinázt használtak, bizonyítékot szolgáltattak annak alátámasztására, hogy a mitokondriálisan kötött hexokináz “preferenciális” vagy “privilegizált” hozzáféréssel rendelkezik az intramitokondriálisan termelt ATP-hez.

A laboratóriumunkban végzett munka szilárd alapot adott annak a nézetnek, hogy az aktívan foszforiláló agyi mitokondriumokban kötött hexokináz valóban szorosan kapcsolódik az oxidatív foszforiláció során keletkező szubsztrát ATP intramitokondriális kompartmentjéhez. E következtetés kísérleti alátámasztását számos közleményben ismertették (BeltrandelRio és Wilson, 1991,1992a,b;de Cerqueira Cesar és Wilson,1995,1998,2002;Hashimoto és Wilson, 2000). E munka teljes áttekintése jelen keretek között nem lehetséges, de néhány fő megállapítást kiemelünk, hogy bemutassuk az ezekben a tanulmányokban alkalmazott különböző kísérleti megközelítések sokféleségét, amelyek mind ugyanarra a következtetésre vezettek.

A kezdeti vizsgálatok (BeltrandelRio és Wilson,1991,1992a,b)spektrofotometriás módszerekkel történtek, amelyekben a különböző intramitokondriális folyamatok (oxidatív foszforiláció, adenilátkináz-reakció, kreatin-kináz reakció) ATP-termelését és a hexokináz általi Glc-foszforilációt összekapcsolták a NADPH-termeléssel, amelyet 340 nm-en követtek nyomon, megfelelő kapcsolóenzimek alkalmazásával. Az alapgondolat az volt, hogy a Glc-foszforiláció sebességének és a különböző forrásokból származó ATP-termelés sebességének összehasonlításával következtetni lehet a különböző intramitokondriális ATP-termelő folyamatok relatív jelentőségére a hexokináz ATP-szubsztrátjának forrásaként. A következtetés az volt, hogy amikor oxidatív foszforiláció zajlott, sem azadenilát-kináz, sem a kreatin-kináz nem volt jelentős szubsztrátATP-forrás. Sőt, az oxidatív foszforiláció által termelt ATP-nek csak egy töredékét hasznosította a hexokináz, aminek eredményeként azextramitokondriális közegben az oxidatív foszforilációmegszűnésével tovább nőtt. A Glc-foszforiláció sebessége azonban nem növekedett folyamatosan az extramitokondriális , azonban annak ellenére, hogy ez utóbbi az oxidatív foszforiláció hiányában hozzáadott extramitokondriális ATP-vel látott Km-hez hasonló volt, azaz a hexokináz nem lett volna “telített” az extramitokondriális ATP-vel mint szubsztráttal (2. ábra). Ez határozottan arra utalt, hogy nem extramitokondriális ATP-t használtak szubsztrátként.

Bár az ATP-termelés szinte azonnal megkezdődött az oxidatív foszforiláció ADP hozzáadásával történő beindítása után, a mitokondriálisan kötött hexokináz által végzett Glc-foszforiláció beindításában jelentős késés mutatkozott (3D ábra) az állandósult állapot eléréséig, amely hosszabb ideig fennmaradt. Ezt a kezdeti késleltetési időszakot úgy értelmeztük, hogy ez az idő szükséges ahhoz, hogy egy intramitokondriális rekesz megteljen az oxidatív foszforiláció által létrehozott ATP-vel, amelyből a mitokondriálisan kötött hexokináz a szubsztrát ATP-t nyerte. Az elektrontranszport gátlása KCN hozzáadásával az ATP látszólagos felszabadulását eredményezte, feltehetően az intramitokondriális kompartmentből, és ennek a “kompartmentnek” a tulajdonságai (a feltöltés kinetikája, kapcsolat az intramitokondriális ATP-termeléssel stb.) kielégítő összhangban voltak az ezen értelmezésen alapuló várakozásokkal (BeltrandelRio és Wilson,1991,1992a,b).Sajnos, a várakozásokkal való egyezés nem tévedhetetlen útmutató a valós tényekhez, és az “ATP látszólagos felszabadulása” később tévesnek bizonyult (Laterveer és mtsai,1993).), amelynek forrása még mindig nem tisztázott, és amelyet a későbbi munkák során nem lehetett reprodukálni (deCerqueira Cesar és Wilson, 1998). E lehangoló és megalázó kudarc ellenére a mitokondriálisan kötött hexokináz és az ATP intramitokondriális kompartmentjének összekapcsolásának alapkoncepcióját más bizonyítékok is alátámasztották, és a későbbi kísérleti teszteknek is ellenállt.

A spektrofotometriás eljárások alternatívájaként kettős izotópos jelölési módszert dolgoztak ki (deCerqueira Cesar és Wilson, 1995). A 14C-jelölt Glc-t a hexokináz szubsztrátjaként használták, a 32Pi pedig az oxidatív foszforilációval történő ATP-szintézishez szolgáltatott szubsztrátot. A32P/14C arány a Glc-6-P-ben így a hexokináz által felhasznált szubsztrát ATP specifikus aktivitásának mérésére szolgált. A mitokondriumokhoz kötött hexokináz által termelt Glc-6-P32P/14C arányát összehasonlítottuk az élesztő hexokináz által termelt értékkel, amely nem kötődik mitokondriumhoz, és így szükségszerűen extramitokondriálisATP-t használ szubsztrátként. A mitokondriumhoz kötött és az élesztő hexokinázok által szubsztrátként használt ATP-poolok jelölésének kinetikája feltűnően eltérő volt, ami ismét összhangban van azzal a nézettel, hogy a mitokondriumhoz kötött hexokináz nem extramitokondriális ATP-t használ szubsztrátként, hanem inkább az oxidatív foszforiláció által biztosított ATP egy intramitokondriális kompartmentjéből táplálkozik.Például (4. ábra) a felesleges 31Pi hozzáadása, ezáltal jelentősen csökkentve az oxidatív foszforilációval szintetizált 32P-ATP specifikus aktivitását, az élesztő hexokináz által előállított Glc-6-P 32P/14C arányának gyors csökkenését eredményezte, extramitokondriális ATP felhasználásával. Ezzel szemben a mitokondriumhoz kötött hexokináz által termelt Glc-6-P 32P/14C arányában késleltetés, majd valamivel lassabb csökkenés következett be. Ez utóbbi megfigyelések ismét összhangban voltak azzal a nézettel, hogy a mitokondriális hexokináz egy olyan intramitokondriális ATP-részleget használt, amely nem volt szabadon egyensúlyban az extramitokondriálisATP-vel.