Az osztás, a fedés és a poliadeniláció három fő lépés a pre-messenger RNS (pre-mRNS) mRNS-é történő feldolgozásában. A poliadeniláció (poli(A)) magában foglalja a pre-mRNS endonukleolitikus hasítását és a poli(A) farok hozzáadását a hasítási helyen . Az egyes pre-mRNS-ek általában néhány hasítási/poliadenilációs (C/P) helyet (polyA helyek vagy pA) tartalmaznak. Az alternatív poliadeniláció (APA) végül több mRNS-poliadenilációs izoformát hozhat létre .

A jelenlegi ismeretek szerint az APA egy átfogó folyamat, amely több kis molekula koordinatív hatásán keresztül valósul meg. A 3′-feldolgozó faktorok az APA szabályozásának fő célpontjai . A tipikus APA-feldolgozás a következő lépéseket foglalja magában: (1) a CFIm (hasítási faktor I) a pre-mRNS UGUA-mezőjéhez kötődik a pA hely előtt, és vonzza a CPSF-et (hasítási és poliadenilációs specifitási faktor) és a CSTF-et (hasítási stimulációs faktor), hogy az RNS-polimeráz II végére gyülekezzen; (2) az RNS-polimeráz II előrehaladtával a CPSF a pA jelszekvenciához kötődik (pl. AAUAAA), a CSTF pedig az új mRNS prekurzorhoz kerül, a GU vagy U-gazdag szekvenciához kötődve; (3) a CPSF és a CSTF a pA jelszekvencia után ~ 35 nukleozid hasítását kezdeményezi, a magban lévő poliadenilációs kötőfehérje (PABPN1) pedig a poliadenilációs farokszekvenciához kötődik a PAP folyamat megkezdéséhez; (4) miközben a PAP által közvetített poliadeniláció folytatódik, ~ 50-250 nukleotid (nt) hosszúságú adenozin farok készül (a szervezet fajától függően), és a CPSF disszociál a kötőszekvenciájából; (5) a PABPN1 molekuláris uralkodóként működik ezen APA-progresszió során, meghatározva, hogy mikor kell leállnia a poliadenilációs folyamatnak; (6) a PAP elkezd disszociálni, bár a PABPN1 továbbra is fenntartja kötődési státuszát. A fenti 6 lépés kombinációja az 5′-capping folyamatával együtt elősegíti az mRNS érését és az esetleges exportálódást a sejtmagból a citoplazmába.

Az emlősök pre-mRNS transzkriptumainak körülbelül 50 ~ 80%-a egynél több pA-helyet tartalmaz . A 3′-UTRof mRNS rejt kulcsfontosságú RNS szabályozó elemeket, amelyek meghatározzák, hogy mikor, hol és mennyi mRNS transzkript kerül lefordításra . Az APA egy kulcsfontosságú 3′-UTR poszt-transzkripciós szabályozási mechanizmus. A 3′-UTR APA izoformák különböző szerepet játszanak az mRNS stabilitásának, lokalizációjának, felezési idejének és funkcióinak meghatározásában. Továbbá korábbi tanulmányok kimutatták, hogy az APA részt vesz a betegség progressziójában és a gyógyszerérzékenységben, különösen a kromatin módosítókat célzó gyógyszerek esetében . Bár az APA-kutatás még korai stádiumban van, egyedülálló poszt-transzkripciós szabályozó hatása potenciálisan mind a rák prognózisának és diagnózisának biomarkerévé, mind pedig az új célzott terápia kifejlesztésének célpontjává teszi .

Hogyan modulálja az APA a pre-mRNS-t

A pA-k elhelyezkedése alapján az APA két fő kategóriába sorolható: UTR-APA (1a. ábra) és kódoló régió-APA (CR-APA) (1b-d. ábra). A CR-APA esetében az alternatív pA-k az exonokban vagy intronokban helyezkednek el. Ezért a CR-APA alternatív splicing (AS) révén befolyásolja a kódoló régiókat, ami különböző C-terminálisú fehérjeizoformák létrehozásához vezet. Az UTR-APA esetében az alternatív pA-k a 3′-UTR-ben helyezkednek el, ami azonos kódoló keretet, de változó 3′-UTR-t tartalmazó transzkripciós termékekhez vezet. Korábbi vizsgálatok szerint a globális UTR-APA események szövetspecifikusak, a3′-UTR rövidülés pozitívan korrelál a sejtproliferációval és negatívan a sejtdifferenciációval .

A pre-mRNS 3′-feldolgozó komplexet több elem alkotja, köztük a kanonikus poli(A) jelzőszekvencia AAUAAA vagy annak közeli változatai (e.pl. AAAUAA, AUAAAA, AUUAAA, AUAAAU, AUAAAG, CAAUAA, UAAUAA, AUAAAC, AAAAUA, AAAAAA, AAAAAA, AAAAAG), amelyek a genomban változó gyakorisággal fordulnak elő, általában a pA helytől 15-50 nts-en belül. Az UGUA elemek gyakran a pA helytől felfelé, az U-gazdag elemek a pA hely közelében, az U/GU-gazdag elemek pedig a pA helytől lefelé ~ 100 nts-on belül helyezkednek el. A humán poli(A) jelek ~ 20%-át azonban nem veszik körül U-/GU-gazdag régiók .

Az emlőssejtek 80 magfaktora közül körülbelül 20 vesz részt a C/P gépezetben . Általában ezek a core faktorok négy elemre oszthatók az alábbiak szerint (2. ábra) :

A CPSF (hasítási és poliadenilációs specifitás faktor) a CPSF1-CPSF4 (más néven CPSF160, CPSF100, CPSF73 és CPSF30), a WDR33 és a FIP1L1 (más néven Fip1) . A jelenlegi felfogás szerint a WDR33 és a CPSF4 közvetlenül kölcsönhatásba lép a pAs-szal, a CPSF3 pedig végzi az endonukleolitikus hasítást . A CPSF komplexként működve felismeri a poliadenilációs jelszekvenciát AAUAAA és hasítja a pre-mRNS-t . Ez szekvencia-specifikusságot biztosít, amely fontos szerepet játszhat a pA hely kiválasztásában, a génexpresszió, a rákos sejtek migrációja, a metasztázis és végül a betegség kimenetelének szabályozásában . A CPSF73 a CPSF komplex részeként egy endonukleáz, amely a pre-mRNS-t a pA helyen hasítja . Oxidatív stressz hatására azonban a CPSF73 transzlokálódik a sejtmagból a citoszolba, és a prosztatarákban a poliadenilációs aktivitás jelentős gátlását okozza . Továbbá a CPSF-komplex egyik tagja, a Fip1 potenciálisan a sejtek önmegújulásának szabályozójaként szolgál. Valóban, a Fip1 depletiója egér embrionális őssejtekben (ESC) a sejtek differenciálatlan állapotának és önmegújító képességének elvesztését eredményezi a preferált disztális poli(A) hely (dpA) használata miatt, ami végül a sejtsorsot meghatározó kiválasztott gének 3′-UTR meghosszabbodásához vezet .

A CSTF (hasítási stimulációs faktor) a CSTF1, CSTF2 és CSTF3 (50 kDa, 64 kDa, illetve 77 kDa) faktorokból áll, és kulcsszerepet játszik a hasítási reakcióban . A CSTF-komplex a hasítási helytől lefelé lévő U- vagy GU-gazdag mezőhöz tud kötődni a hasítás fokozása érdekében. Például a CSTF2, más néven CSTF64 közvetlenül kölcsönhatásba lép az U/GU-gazdag régióval a 3′-terminális feldolgozás hatékonyságának modulálása érdekében . Egyes tanulmányok arról számoltak be, hogy a CSTF nemcsak a pAs használatát segíti elő, hanem befolyásolja a sejtproliferációt is, és potenciálisan a rák inváziójának és prognózisának biomarkereként működik . A CSTF64 alapvető poliadenilációs faktorként és a 3′-UTR-rövidülés fő szabályozójaként működik több tumortípusban. A CSTF64 expressziója összefüggésbe hozható a tüdőrák rossz prognózisával, és a CSTF64 túlexpressziója elősegíti a tüdőráksejtek proliferációját és invázióját .

A CFI és CFII (hasítási faktorok I és II) a CFIm25 (más néven NUDT21/nudix hydrolase 21/CPSF5), CFIm59 és CFIm68 faktorokból áll, amelyek mindegyike a konzervált UGUA motívum előtt kötődik a hasítási reakció közvetítése érdekében . A CFIm kötődés a pA helyek elsődleges meghatározójaként működhet azáltal, hogy egy teljes pA régiót hurokba zár, és ezáltal egy APA hely kiválasztását indukálja . Más fehérjék, köztük a szimplekin, a poli(A)polimeráz (PAP) és a poli(A)-kötő fehérje (PAB) is szabályozhatják az APA-hely kiválasztását. A PAB-ok (PABII, RBBP6, PABPN1) a növekvő poli(A) farokhoz kötődnek, megakadályozva a CPSF és a poli(A) polimeráz közötti kölcsönhatást. Ezek a tevékenységek elsősorban akkor jelentkeznek, amikor a farok ~ 250 nts, és a céljuk a poli(A) farok hosszának szabályozása, miközben az APA progresszióban van .

A C/P gépezetben résztvevő faktorok általában részt vesznek az APA szabályozásában. Közülük a CFIm25-et az APA fő globális szabályozójaként azonosították, amelynek knockdownja nemcsak globális váltást indukál a proximális poli(A) jel használatára, hanem fokozza a célgén stabilitását és expresszióját is . Huang és munkatársai arról számoltak be, hogy a CFIm25 depletio jelentősen növeli a CCND1 és a GSK3β transzkript szintjét, továbbá csökkenti a dPAS felhasználását több onkogén (IGF1R, CCND1 és GSK3β) által . Továbbá, a génontológiai elemzések (GO) kimutatták, hogy a CFIm25 nemcsak az APA-t modulálja a MAPK jelátviteli útvonalakon keresztül, hanem a rák-asszociált jelátviteli és fehérje ubikvitinációs jelátviteli útvonalakhoz is kapcsolódik . Továbbá, a CFIm25 és a CFIm68, de nem a CFIm59 depletiója proximális poliadenilációs helyek szelekciójához vezet HEK293 sejtekben . Xia és munkatársai azonban arról számoltak be, hogy a CFIm25 expressziója nem különbözik a tumorszövet és az egészséges szövetek között . Kubo és munkatársai arról is beszámoltak, hogy a CFIm-nek nincs szerepe a poli(A)-hely szelekcióban . Továbbá Takagaki és munkatársai kimutatták, hogy a CSTF64 az első tényező az APA 3′-végű feldolgozásában, és hogy az IgM képes az APA-t használni az egér B-sejtek aktiválásához . Bár úgy tűnik, hogy a CFIm kulcsszerepet játszik az APA szabályozásában, pontos szerepe még mindig tisztázatlan .

RNS-kötő fehérjék (RBP-k) szintén befolyásolhatják az APA mRNS-eket célzó képességét azáltal, hogy versengenek a poliadenilációs gépezet fehérjéivel vagy fokozzák azok célhelyéhez való kötődését . Xiang és munkatársai elemezték a globális APA-profilokat egy nagy adatbázisból a különböző ráktípusok között, és azt javasolták, hogy a PABPN1 az APA-profilok fő szabályozója a különböző ráktípusok között. Egy CTRP-adatkészlet kimutatta, hogy a PABPN1 expresszió statisztikailag korrelál a 31 gyógyszerrel szembeni érzékenységgel . Az RBP-k önmagukban megakadályozhatják más APA faktorok kötődését a proximális poli(A) helyekhez, vagy befolyásolhatják az APA szelekciót az RNS stabilitásának fenntartásában betöltött szerepe révén . Továbbá az RBP-k szabályozhatják a dinamikus APA-profilt és elősegíthetik a mitózis-meiózis átmenetet .

Hogyan szabályozódik az APA

Az APA egy nagyon átfogó molekuláris biológiai folyamat, amely számos sejtes elemet érint. Jelenleg még mindig nem sokat tudunk erről az egyedülálló biológiai folyamatról. A helyzet azonban nagyon rövid idő alatt gyorsan javult, miután a tudományos közösség megérezte az APA jelentőségét a sejtbiológiában és potenciális szerepét új rákterápiás célpontként. Az APA számos központi faktor dinamikusan és térben-időben koordinált folyamata. A CFIm például képes kötődni a pre-mRNS-ben lévő specifikus RNS-szekvenciához, majd a CPSF egyik CPSF-alegységével, a hFip15 -el való kölcsönhatásán keresztül rekrutálja a CPSF magfaktort. A CSTF-64 kölcsönhatásba léphet a CPSF73-mal, de a CFIm25-vel nem. Megfigyelték, hogy mind a CSTF64, mind a CPSF73 szintje emelkedett az egészséges szövetbe vándorló sejtekben, de a CFIm25 szintje nem . A CFIm részt vesz a pre-mRNS 3′-feldolgozó komplexe összeállításának korai lépésében a hasítás és a poli(A) addíció alternatív serkentése vagy elnyomása révén, a saját vagy más core faktorok szintjétől és a potenciális hasítási helyeket körülvevő RNS szekvenciától függően .

A core faktorok mellett számos fiziológiai körülmény is részt vesz az APA szabályozásában, mint például a helyi kromatin szerkezet, nukleoszóma pozícionálás, DNS metiláció és hiszton módosítások . Érdekes módon néhány, az 5′-terminális lefedésben részt vevő faktor is befolyásolhatja mind a hasítás, mind a poliadeniláció hatékonyságát .

Az APA emellett a transzkripció szintjén is szabályozható. A transzkripciós gépezet, mint például a transzkripció iniciáció, progresszió és splicing, valószínűleg befolyásolja a poliadeniláció hatékonyságát és specificitását . Ezért a promóter régió specifikus szekvencia elemei és a poli(A)-hely szelekciója közötti kapcsolat vizsgálata nagymértékben segíthet bennünket az ezen érdekes jelenség mögött álló mechanizmus feltárásában, ami potenciálisan segíthet egy új rákterápiás stratégia kifejlesztésében .

Hogyan elemzik módszertanilag az APA-t

Mióta 1980-ban megfigyelték a pA-k hatását az IgM és a dihidrofolát reduktáz (DHFR) gén kódolásában, egy sor szigorú kutatási módszert és stratégiát fejlesztettek ki az APA azonosítására és tanulmányozására, mint például a Poly(A)-ClickSeq következő generációs szekvenálási (NGS) technológia . Ezen új módszerek támogatásával, különösen az NGS technológia fejlődésével és az említett génexpressziós variánsok szekvenálási adatainak gyors felhalmozódásával a kísérletileg meghatározott genetikai pA adatbázisok folyamatosan bővülnek .

A 3′-dúsított RNS-seq protokollok alapján az APA elemzési módszerek főként két kategóriába sorolhatók: oligo (dT) priming alapú módszerek és RNS manipuláció alapú módszerek . Mivel az APA felfedezéséhez csak az mRNS 3′ -terminálisára leképezett olvasatok hasznosak, az olvasatok száma korlátozta ezeket a módszereket. Ha az 5′- és 3′-terminálisokra vonatkozó leolvasási lefedettség alacsony, az RNS-seq nem lesz alkalmas a pA-k pontos és széles körű azonosítására. Ezenkívül egy másik kihívás az izoformák átfedéséből adódó olvasás-térképezési kétértelműség feloldása. Bár a leolvasási hossz korlátozza, számos RNA-seq algoritmust fejlesztettek ki a 3′-UTR hosszában bekövetkező relatív változások számszerűsítésére, és így az APA események előrejelzésére. Az elmúlt években számos pA detektálási és APA analitikai módszert és algoritmust is kifejlesztettek, mint például a Dynamic Analyses of Alternative PolyA Adenylation (DaPars), 3USS, MISO, Roar, QAPA és Change Points . Egy 2019-es áttekintésben Gruber és Zavolaneloquently összehasonlította ezeket a módszereket .

A DaPars a legnépszerűbb adatelemzési módszer közülük, bár a QAPA hatékonyabb és érzékenyebb . A DaPars RNS-seq adatok alapján azonosítja a disztális pA-kat, majd egy regressziós modellt használ a dinamikus APA események de novo azonosítására és mennyiségi meghatározására két feltétel között, függetlenül az előzetes APA annotációtól. A szekvenált olvasatok keletkezésének valószínűsége egységes az egyes izoformák között. A pA-k olyan pozíciókban vannak jelen a génhelyszínek mentén, amelyek határozott csökkenést mutatnak az RNS-szekvencia olvasási lefedettségben . A géntest mentén az esetleges RNS-seq nem egyenletességi torzítás korrigálása után a proximális APA-hely pontos helye azonosítható, és a statisztikailag szignifikáns dinamikus APA-k és aktivitásuk ezután kimutatható. A DaPars legfontosabb módszertani újítása a de novo APA események közvetlen következtetése a meglévő RNS-seq adatokból, anélkül, hogy további kísérletekre támaszkodna. A DaPars további előnye, hogy a cutoffok növelésével képes feloldani a szomszédos gének átfedéseit, amelyek hamis pozitív eredményeket adhatnak. A lokuszok mentén nem egyenletes olvasási lefedettség miatt azonban ez a módszer korlátozza a de novo poli(A)-hely detektálásának pontosságát, növelve a hamis pozitív arányt.

AQAPA kvantitatív módon következtet az APA-ra a hagyományos RNS-seq adatokból az abszolút alternatív 3′-UTR izoforma expresszió közvetlen becslésével. Ezután kiszámítja az egyes izoformák relatív expresszióját az összes izoforma között az APA értékeléséhez . A QAPA korlátja, hogy előre meghatározott pA-kat igényel. Ez a probléma azonban enyhíthető a 3′-UTR RNS-szekvenciákból és más forrásokból származó adatokat tartalmazó, annotált pA-k bővített erőforrásának létrehozásával. A transzkriptek 3′-terminusán a leolvasási lefedettségi torzulások, a nem-templált poli(A)-farok-tartalmú leolvasások gyenge hozama és az átfedő transzkript izoformák leolvasásának kétértelműsége miatt a kanonikus RNS-seq adatokon alapuló módszerek korlátozottak, miközben a pA-k pontos feltérképezésére tesznek kísérletet. A molekuláris technológia fejlődésével azonban az APA vizsgálatára szolgáló módszerek folyamatosan bővülnek. Wang és munkatársai a CRISPR / Cas9 módszert alkalmazták az APA biológiai funkciójának tanulmányozására a gyenge poli(A) jel kanonikus poli(A) jellé történő szerkesztésén keresztül, és a jelek célzottan specifikus poli(A) helyekre történő irányításával .

Röviden, a jelenleg rendelkezésre álló APA elemzési módszerek mindegyikének megvannak az előnyei és korlátai. A kanonikus RNS-seq adatokon alapuló analitikai stratégiákat használják leginkább az APA kutatóközösségen belül.

Egysejt szintű vizsgálat Az egysejtes megközelítés előnye, hogy jelentősen csökkentheti az ömlesztett sejtekből származó háttérzajt, amely különböző szövetekből vagy differenciálódásokból származó sejtekből kivont RNS anyag keverékét tartalmazza.

Az egysejtes analitikai technológia fejlődésével a közelmúltban vizsgálták a sejtek közötti APA változásokat . Bár az egysejtes APA-kutatást ritkán végezték nagy léptékben, ez a technika nagy mélységű és teljes hosszúságú egysejtes RNA-seq (scRNA-seq), ami lehetővé teszi az APA pontos elemzésének lehetséges eszközét. A Jingle Bells és az scRNA-SeqDB (https://bioinfo.uth.edu/scrnaseqdb/) scRNA-seq adatkészleteket használt fel különböző ráktípusok vizsgálatára . Ye és munkatársai beszámoltak a scRNA-seq adatok felhasználásáról a dinamikus APA-felhasználás változásainak vizsgálatára különböző csontvelő mononukleáris sejttípusokban egy nagy mintagyűjteményből, amely egészséges kontrollokat és AML-betegeket is tartalmazott. Azt találták, hogy az egészséges egyénekkel összehasonlítva az AML-betegek nyolc különböző sejttípus között alacsonyabb APA-diverzitással rendelkeznek. Kimutatták továbbá az APA-szabályozás kiterjedt részvételét az eritropoézisben a leukémia progressziója során egysejtes szinten . Kim és munkatársai 11 emlőrákos betegből kinyert 515 scRNS-seq adatkészlet elemzésével arról számoltak be, hogy sejttípus-specifikus APA azonosítható egysejtes szinten a 3′-UTR hosszváltozása alapján, a génexpressziós szint és az APA mintázatok kombinációjával. Továbbá kimutatták, hogy az immun-specifikus APA szignatúrák emlőrákban potenciálisan felhasználhatók a korai stádiumú emlőrák prognosztikai markereként .

APA és alternatív splicing: Bár az APA és az alternatív splicing (AS) között jelentős különbségek vannak, mind az APA, mind az AS különböző izoformákat hozhat létre, sőt a pre-mRNS folyamat során kölcsönhatásba léphetnek egymással. Továbbá, míg az APA-nak négy tipikus izoformája van, addig az AS-nek hat (2. ábra). A különböző emberi szövetekből és sejtvonalakból származó transzkriptomikai adatok számos mélyreható elemzése erős korrelációt mutatott ki az APA és az AS között. Ha a pA a terminális exonon belül van, az APA az AS egy speciális típusaként, CR-APA-ként viselkedhet, amely nem rendelkezik in-frame stop kodonnal vagy 3′-UTR-rel, és valószínűleg gyorsan lebomlik a non-stop kód által közvetített mRNS bomlási folyamat révén (1b. ábra) . Shen és munkatársai arról számoltak be, hogy az APA és az SRSF3 splicing faktor együttesen modulálják a sejtek öregedési folyamatát . Míg az APA szerepet játszhat néhány splicing faktor által közvetített AS-ben, a splicing faktorok az APA elemekkel is együttműködve segíthetik ezt a folyamatot. Például az U2AF2 és az RBP-k képesek kölcsönhatásba lépni és a CFI-t rekrutálni, hogy elősegítsék a 3′-terminus kialakulását a polipirimidin-traktusok közelében . Továbbá a CPSF komplex kölcsönhatásba léphet a splicing faktorral TFIID (transzkripciós faktor II D) az RNS-polimeráz II szabályozásában . Az is megfigyelhető, hogy az U1 snRNP (kis nukleáris ribonukleoprotein) az intronokon belül is működhet azáltal, hogy elnyomja a korai hasítást és a poliadenilációt. Az U1 depletio szintén az intron poli(A) jelek aktiválódásához vezet, és genom-szerte APA-t okoz .

AS és APA is versenyeznek egymással, míg a CR-APA-ban. Például a splicing factor 3B subunit1 (az U2 snRNP egyik összetevője, más néven SF3b1) ablációja aktiválhatja az intron PAS-t. Az U1 snRNP önállóan is befolyásolhatja az APA splicing aktivitását . Mivel az U1 snRNP képes a transzkript 5′-terminális régiójához kötődni és blokkolni a potenciális hasítófaktorok felismerését, az U1 snRNP kiütése növeli a pA helyek kihasználtságát az intronokon belül, közel ehhez a transzkriptterülethez . Movassat és munkatársai azonban kimutatták, hogy az APA és az AS közötti kapcsolat a terminális intronokra korlátozódik . Azt is kimutatták, hogy a CstF64 knockdown közvetve befolyásolhatja a hnRNP A2/B1, de nem az APA AS-ét HeLa sejtekben .

Hogyan szabályozza az APA a sejtciklust

Sok gén, köztük a TP53, CDC6 (sejtosztódási ciklus 6), CyclinD1 (CCND1) és CDK (ciklinfüggő kináz), kapcsolódik a sejtciklus ellenőrzőpontokhoz és szabályozza a sejtciklus progresszióját. Mivel a pre-mRNS általában egynél több pA-helyet tartalmaz, a sejtciklus szempontjából releváns géntermékeket az APA-mechanizmus modulálja, és különböző izomereket hoz létre. A DNS-replikáció egyik fő szabályozójának, a CDC6-nak a 3′-UTR rövidülése magasabb CDC6 fehérjeszintekkel és fokozott S-fázisba való belépéssel függ össze emlőrákos sejtekben . A ciklin D1, amely számos sejttípusban kritikus szerepet játszik a G1-S fázis átmenet elősegítésében, mind az UTR-APA, mind a CR-APA mechanizmusokon keresztül APA szabályozás alá esik . Ezenkívül Xiang és munkatársai megvizsgálták az APA eseményekkel összefüggő 20 532 gén felső 10%-át, és megfigyelték, hogy e gének többsége kromatinszerkezettel kapcsolatos tevékenységekben vesz részt, ami az APA-feldolgozás és a kromatinszerkezet módosítása közötti kapcsolatra utal . Mitra et al. megállapította, hogy az APA a sejtciklus és a szöveti migráció közötti kapcsolatként működik egerek dermális kimetszési sebeinek elemzésével . Kimutatták, hogy a sebek melletti proliferáló sejtek nagyobb mértékben expresszálják az APA faktorokat, mint a nyugalmi állapotban lévő fibroblasztok a nem sérült bőrben. A PIGN, amely a sejtciklust az orsóösszeszerelési ellenőrzőpont fehérjékkel való kölcsönhatáson keresztül szabályozza, a 3′-UTR-ében 6 pA helyet találtak (3. ábra) .

How APA interacts with miRNA in post-transcriptional modulation

More 50% of conserved microRNAs (miRNAs) target sites residing downstream of proximal pAs in mammalian genes. Ennek eredményeként az UTR-APA kulcsszerepet játszik a transzkriptek és a miRNS-ek közötti kölcsönhatás szabályozásában . Az APA-t a közelmúltban a génstabilitást és a génexpressziót szabályozó, széles körben elterjedt mechanizmusként azonosították. A miRNS-célzóhelyek többnyire a 3′-UTR-ben helyezkednek el . A rövidebb 3′-UTR hosszúságú transzkriptek általában stabilabbak a miRNS-ek célpontjainak elvesztése miatt. Korábban kimutatták, hogy az APA kulcsfontosságú szabályozási mechanizmus számos ráktípusban, például glioblasztóma tumorban, hepatocelluláris karcinómában, prosztatarákban és emlőrákban . Gruber és munkatársai azonban arról számoltak be, hogy a 3′-UTR rövidülésnek csak korlátozott hatása van az egér és humán T-limfociták proliferációjára. Azt is kimutatta, hogy nem minden APA esemény kapcsolódik magasabb fehérjeszinthez . Számos tanulmány arról számolt be, hogy az APA hatása az mRNS stabilitására és a riboszóma terhelésére marginális, a sejttípus-specifikus miRNS-expressziótól és az RNS-kötő fehérjék elérhetőségétől függően . Tipikus példa erre a PAX3 génexpressziójának szabályozása. A PAX3 a miogén differenciálódás egyik fő szabályozója, amelynek transzkriptuma a 3′-UTR-ben miR-206 célterülettel rendelkezik. A PAX3 izoformák azonban változatos differenciálódási mintázatot mutatnak a különböző izomtípusokban .

Az APA az intronokban elhelyezkedő miRNS-célpontokat is képes modulálni. A ZFR gént az intronikus miRNS (miR-579) célozza az U87 sejtvonalban. Hinske és munkatársai arról is beszámoltak, hogy az APA jel szerepet játszik a miRNS negatív visszacsatolásának eljuttatásában a ZFP génhez .

Az APA nemcsak a 3′-UTR rövidítésével befolyásolja a génexpressziót a miRNS-célzóhelyek eltávolítása érdekében, hanem más molekuláris mechanizmusokon keresztül is. Masamha és munkatársai arról számoltak be, hogy a CFIm25 és a miR-23 függetlenek voltak az egyik glutamináz izoforma 3′-UTR-jének expressziójának elnyomásában . Ezért, bár az mRNS a miRNS-szuppresszió elől a 3′-UTR rövidítésén keresztül menekül a miRNS célterületének eltávolítása érdekében (egy kanonikus APA mechanizmus), más APA és miRNS kölcsönhatási mechanizmusok is léteznek.

Tekintetek

Az APA viszonylag új biomedicinális kutatási terület. Bár az APA-kutatásban az elmúlt néhány évben elértünk néhány mérföldkőnek számító eredményt, még sok minden tisztázásra vár (4. ábra). Az APA-vizsgálatok az elmúlt néhány évben a különböző transz-hatású faktorok közvetlen hatásaira összpontosítottak. A jövőbeni vizsgálatok remélhetőleg e transz-ható faktorok molekuláris és sejtszintű jelszabályozására fognak koncentrálni. Ismeretes, hogy az APA döntő szerepet játszik a pre-mRNS-ek szerkesztésében és a későbbi mRNS izoformák specifitásának és stabilitásának meghatározásában. Az APA részt vesz a veleszületett vírusellenes immunválasz modulálásában, a rák beindulásának és prognózisának szabályozásában, valamint a gyógyszerrezisztencia kialakulásában. Eközben az APA eltérően viselkedik az egyes gének, sejttípusok, szövettípusok és még a betegségek esetében is. Az APA és átfogó szabályozási mechanizmusainak megértése az emberi betegségekben új helyszínt nyit a precíziós orvoslás és a személyre szabott orvoslás folytatásához.

.