Génterápia nem örökletes rendellenességek kezelésére

A krónikus szervi károsodásban szerepet játszó mechanizmusok azonosításában számos előrelépés történt, ami utat nyitott a génterápiás vizsgálatok számára. Míg az elmúlt évtizedekben preklinikai és klinikai vizsgálatok sokasága összpontosított az örökletes betegségek génterápiájának fejlesztésére, az állatmodelleken végzett számos preklinikai vizsgálat ellenére csak néhány klinikai vizsgálatot végeztek a génterápia nem örökletes betegségek terápiás hatékonyságának vizsgálatára. Egy nemrégiben készült tanulmány szerint a telomeráz expressziója AAV9 vektorok segítségével terápiás hatást fejt ki a tüdőfibrózis egérmodelljében. Ez a terápia az idiopátiás tüdőfibrózist célozta. Ismeretes, hogy a telomerek védőszerkezetként működnek a kromoszómák végén, és a rövid telomerek jelenléte bizonyítottan a betegségek kialakulásának egyik oka. Ebben az állapotban a telomerek túl rövidek lesznek, ami a sejtosztódás leállásához vezet, ami viszont a sejtek apoptózisához vezet. A telomeráz egy olyan enzim, amely képes átstrukturálni a telomerek hosszát, és Povedano és munkatársai kifejlesztettek egy kezelést, amely AAV 9-es szerotípusú AAV segítségével telomerázt juttat a rövid telomerek korrigálására. Mivel az AAV9 előnyben részesíti a regeneratív alveoláris II. típusú sejteket (ATII), az AAV9-Tert kezelt egerek jobb tüdőfunkciót mutatnak, csökkent gyulladással és fibrózissal 1-3 héttel a vektoros kezelést követően. Érdekes megjegyezni, hogy a tüdőfibrózis a génterápia 8 hete után javult vagy eltűnt. Az AAV9-Tert kezelés hosszabb telomerekhez és az ATII sejtek fokozott proliferációjához, valamint alacsonyabb DNS-károsodáshoz, apoptózishoz és szeneszcenciához vezetett.

AAV vektorból származó szívgénterápia teljesen új platformként jelenik meg a szívbetegségek kezelésére. A szívelégtelenségre irányuló AAV-génterápiát validálták preklinikai vizsgálatokban állatmodellekkel, és e megközelítések túlnyomó többsége a kardiomiociták kalciumkezelésének javítására irányult. Az e vizsgálatok többségében használt terápiás fehérje a szarkoplazmatikus kalcium-ATPáz (SERCA2a) volt. A pozitív preklinikai eredmények alapján az első klinikai vizsgálat (CUPID trial: calcium upregulation by percutan administration of gene vector in cardiac disease, NCT02346422) során a SERCA2a-t AAV 1-es szerotípusú vektor segítségével juttatták be előrehaladott szívelégtelenségben szenvedő betegek kezelésére . Ennek az 1. fázisú vizsgálatnak az eredménye sikeres volt, nemkívánatos események nélkül, és továbbhaladt a 2a fázisú vizsgálatba, amely ígéretes eredményeket hozott, a nemkívánatos események jelentősen alacsony aránya mellett. A 2b fázisú klinikai vizsgálat (CUPID2b vizsgálat, NCT01643330) eredményei azonban kiábrándítóak voltak, mivel a kezelt csoport és a placebocsoport között nem volt jelentős változás. Ez vezetett a betegek toborzásának leállításához két további, AAV1.SERCA2a-t használó vizsgálathoz . Érdekes, hogy két új, hamarosan induló vizsgálat célja az S100A1 AAV9 vektorral és a fehérje-foszfatáz 1 inhibitorok konstitutívan aktív formájának, az I1c-nek az AAV2 és AAV8 szerotípusú kiméra kapsziddal történő beadása . Ezenkívül az AAV1, az AAV6 és az AAV9 váltak a legígéretesebb AAV-szerotípusokká a szívgéntranszferhez, ami reményt ad a jövőben a szívelégtelenség kezelésére irányuló sikeres génterápiás megközelítésekre.

AAV-közvetített génterápiás megközelítésekről is beszámoltak a neuropátiás fájdalom kezelésére rágcsálókban . Fischer és munkatársai kimutatták, hogy a Ca2+ csatorna-kötő domén 3 (CBD3) gént expresszáló rAAV beadása jelentősen csökkentette a fájdalmas viselkedést, például a tűvel való érintést követő hiperalgéziát vagy az aceton stimulációra való érzékenységet a gyulladásos és neuropátiás fájdalom állatmodelljeiben . Egy másik, az akut fájdalom fontos célgénjének számító vanilloid receptor 1 (TRPV1) elleni rövid hajtű RNS-t (shRNS) kódoló AAV9 vektorral végzett vizsgálat kimutatta, hogy a terápia 10-28 nappal a kezelés után a kímélt idegsérülés (SNI) egérmodelljében csillapította az idegsérülés okozta termikus allodíniát (a neuronok fokozott válasza) . Ezek az eredmények pozitív bizonyítékot szolgáltatnak arra, hogy a génterápiás kutatókat AAV-vektor alapú kezelések kifejlesztésére ösztönözzék a krónikus/diabetikus neuropátiás fájdalomban szenvedő betegek számára.

A krónikus májfibrózis kezelésére irányuló génterápiás megközelítésben jelentős előrelépés történt. Bár az angiotenzin-konvertáló enzim (ACE) gátlókat vagy az angiotenzinreceptor-blokkolókat (ARB) széles körben alkalmazzák a magas vérnyomásban szenvedő betegek kezelésében, ezeket krónikus májbetegségben szenvedő betegeknél is kipróbálták; az eredmények azonban nem voltak meggyőzőek, főként azért, mert káros szisztémás mellékhatásokat okoznak. A gyógyszeres kezelések hiánya miatt a májtranszplantáció elkerülhetetlenül az egyetlen lehetőséggé vált a krónikus májfibrózis és/vagy májzsugor miatt végstádiumban lévő májbetegségben szenvedő betegek számára. Ráadásul a krónikus májbetegség növekvő előfordulása, a donorszervek hiánya, a transzplantáció utáni szövődmények és a májátültetés magas költségei miatt nagy szükség van a májfibrózis/cirrózis specifikus, hatékony, biztonságos és olcsó új terápiáinak felfedezésére és kidolgozására.

Az egyik lehetséges megközelítés ennek megkerülésére a szervcélú antifibrotikus stratégiák kifejlesztése. A laboratóriumunkban végzett vizsgálatok szerint az egyik lehetséges célpont a renin-angiotenzin rendszer (RAS) “alternatív tengelye”, amely magában foglalja annak kulcsenzimét, az angiotenzin-konvertáló enzim 2-t (ACE2), amely az erős profibrotikus oktapeptidet, az angiotenzin II-t (Ang II) antifibrotikus heptapeptiddé, angiotenzin-(1-7) (Ang-(1-7)) bontja. Kísérletes állatkísérletekből származó bizonyítékok azt mutatták, hogy a rekombináns humán ACE2 (rhACE2) jótékonyan hat a magas vérnyomás megelőzésére a szív- és érrendszeri betegségekben, és javítja a vesefunkciót a diabéteszes nefropátiában . Érdekes módon a rhACE2-t egy 1. fázisú klinikai vizsgálatban egészséges emberi önkéntesek egy csoportja jól tolerálta, anélkül, hogy nemkívánatos kardiovaszkuláris mellékhatásokat okozott volna. Van egy tanulmány, amely a rekombináns ACE2 terápiás hatásairól számolt be kísérleti májfibrózisban, amelyben a májkárosodást sebészi úton kolestázissal vagy hepatotoxikus szén-tetraklorid injekcióval idézték elő . Kimutatták, hogy a rekombináns ACE2 jelentősen csökkentette a májfibrózist a májbetegség mindkét állatmodelljében . E szisztémás megközelítés egyik fő hátránya azonban az, hogy a kezelés elkerülhetetlenül off-target hatásokat eredményez, amelyek sok esetben nemkívánatosak. Így a rekombináns ACE2 szisztémás adagolásának számos hátránya van. Ez magában foglalja az ACE2 napi injekciózását, egy olyan eljárást, amely klinikai környezetben invazív és drága megközelítés, amely nemkívánatos hatással van a vérnyomás szabályozására . E probléma megkerülése érdekében ideális megközelítés lenne a szövetspecifikus ACE2-szintek növelése a célszervben. Így a májspecifikus rekombináns AAV-vektorral történő szervspecifikus ACE2-aktivitás-növelés várhatóan a célszervre korlátozódó terápiás hatásokat eredményez, miközben minimalizálja a nemkívánatos off-target hatásokat.

A májspecifikus kapszid-szerotípus használata mellett a specifitás tovább fokozható a vektor ACE2-génnel való megtervezésével egy erős májspecifikus promóter, az apolipoprotein E/humán α1-antitripszin transzkripciós kontrollja alatt. A laboratóriumunk által publikált tanulmányok egy pszeudotipizált májspecifikus AAV-vektort (rAAV2/8) használtak preklinikai értékelésre, és megállapították, hogy az egerekbe juttatott egér ACE2 gén hepatikus overexpressziója akár 6 hónapig is eltartott egyetlen intraperitoneális injekciót követően. Ezután a rAAV2/8-ACE2 egyszeri intraperitoneális injekciójával kezeltünk egereket különböző májbetegség-modellekkel, köztük epevezeték-ligációval (BDL) kiváltott epeúti fibrózissal, szén-tetraklorid (CCl4) injekcióval kiváltott toxikus károsodással és a metionin- és kolinhiányos (MCD) diétával etetett zsírmáj-asszociált májfibrózissal . A kezelés hatására jelentősen megnőtt az ACE2 expressziója és fehérjeaktivitása, ami a májra korlátozódott, anélkül, hogy más fő szerveket érintett volna. Az örökletes betegségekkel, például a hemofília B-vel ellentétben, ahol a májban a transzgén viszonylag alacsony szintű expressziója elegendő lehet a vér FIX-szintjének későbbi kis mértékű emelkedéséhez, a nem örökletes betegségben a terápiás beavatkozáshoz szükséges transzgén expresszió nagyságrendje lényegesen nagyobb lehet. Ez viszont kihívást jelenthet a génterápiával foglalkozó kutatók számára. Érdekes módon azonban a rAAV2/8-ACE2-vel végzett májcélú terápiás megközelítésünkben azt találtuk, hogy a máj ACE2-expressziójának növelése több mint 50%-kal csökkentette a profibrotikus Ang II májszintjét a humán szérumalbumint hordozó kontrollvektorral (rAAV2/8-HSA) kezeltekhez képest. Az Ang II csökkentése, amely az antifibrotikus Ang-(1-7) peptid hepatikus szintjének növekedésével járt együtt, a gyulladásos citokinek expressziójának jelentős csökkenését eredményezte, ami a májfibrózis mélyreható csökkenéséhez vezetett mindhárom modellben (2. ábra) . Ezeket a rövid távú állatmodellekkel végzett vizsgálatokat tovább validálták, hogy bizonyítékot szolgáltassanak arra, hogy az epeúti fibrózis és a zsírmájbetegség hosszú távú állatmodelljeiben, amelyek az ilyen betegségekben szenvedő betegeknél tapasztaltakhoz jobban hasonlítható májelváltozásokat produkálnak, a rAAV2/8-ACE2 egyszeri intraperitoneális injekciója a májfibrózis mélyreható csökkenését okozta (3. ábra). Az AAV-vektorokkal végzett más vizsgálatokkal ellentétben azt találtuk, hogy a rAAV2/8-ACE2 csökkentette a szérum alanin-transzamináz (ALT) szintjét a beteg állatokban a kontrollvektort (rAAV2/8-HSA) kapott állatokhoz képest, ami arra utal, hogy maga a vektor biztonságos a májban. Ezenkívül az egészséges egerekbe beadott rAAV2/8-HSA (10 napig) vagy rAAV2/8-ACE2 (24 hétig) vektor nem okozott változást a plazma ALT-szintjében, ami megerősíti, hogy maga a vektor valószínűleg nem okoz májkárosodást . A májfibrózisban rAAV2/8 vektorral végzett ACE2 génterápiához kapcsolódó molekuláris mechanizmus sematikus ábrázolása a 4. ábrán látható.

A rAAV2/8 vektorral történő májcélú génszállítás terápiás szempontból ígéretesnek bizonyult a felnőtt májban, de hatásaikat nem vizsgálták széles körben az éretlen májban. Bár a rAAV2/8 nagy hatékonysággal transzdukálja az újszülött egér máját, a vektor nem tartós a májban, és a máj növekedésével gyorsan csökken. Ezért a rAAV2/8 közvetítésű terápia sikeres alkalmazásához a korai gyermekkori májbetegségek kezelésére szükség lehet az újbóli beadásra . Ezzel összhangban egy másik tanulmány kimutatta, hogy az ornitin-transzkarbamiláz (OTC)-hiányos újszülött egerek AAV2/8-OTC terápiával történő kezelése felnőttkorban nem védte meg az egereket a hiperammonémiától . Így a stabil transzdukció előállítása a fejlődő májban továbbra is az egyik legnagyobb kihívás a májspecifikus rAAV2/8 génterápia számára, és a vektorok újbóli beadása szükséges lehet a terápiás hatékonyság fenntartásához felnőttkorban a korai neonatális kezelés után.

Noha a preklinikai vizsgálatokban alkalmazott AAV-vektorok hatékonyak lehetnek az emberi májban, fontos a humán hepatocitákra specifikus, fokozott transzdukciós hatékonyságú AAV-vektor kiválasztása . A közelmúltban két csoport javasolta, hogy humanizált egereket, például az immunszupprimált FRG (Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-) egérmodellt használják a legjobb rAAV-szerotípus azonosítására a májra irányuló génterápiához . A több mint 25%-ban emberi hepatocitákkal benépesített humanizált egérmodellben végzett vizsgálatok lehetővé tették a kutatók számára, hogy azonosítsák a humán májspecifikus AAV-vektorokat, például a kapszid DNS-sel kevert AAV-könyvtárból származó LK-03-at. Ezt a könyvtárat 10 AAV-kapszid gén felhasználásával hozták létre. Az LK-03, amely öt különböző szülői AAV-kapszidból áll, nagyobb hatékonysággal tudott humán primer hepatocitákat in vitro és hepatocelluláris karcinóma xenograft modellben in vivo transzdukálni, mint a 8-as szerotípusú AAV. Wang és munkatársai szintén magasabb májtranszdukciós szintről számoltak be FRG egerekben az AAVrh10, egy rhesus makákóból származó E kládba tartozó AAV és az AAV3B kapszidját használva, és kimutatták, hogy az AAV-LK-03 vektorok jobbak lehetnek az AAV3B-nél vagy az AAV8-nál. A kutatók várhatóan egyre gyakrabban fognak humanizált állatmodelleket használni a májbetegségektől eltérő betegségek esetében, ami lehetővé teszi számukra a mesterséges AAV-vektorok új változatainak, a transzdukció hatékonyságának és a vizsgált emberi szövetre jellemző immunreakcióknak az azonosítását. Ezenkívül arról számoltak be, hogy az AAV3B-eGFP vektor, amely nem emberi főemlősök májában májspecifikus robusztus GFP-expressziót tudott okozni, lényegesen jobb, mint az AAV8, és nem mutatható ki hepatotoxicitás .

.