A transzkripciós apparátus dinamikus mechanizmusa, amely megbízható válaszokat szervez az aktivátorokra

jún 20, 2021

admin

A TA dinamikájának matematikai jellemzése

A TA dinamikáját az határozza meg, hogy a komponensek térben és időben hogyan szerveződnek a promóteren. Mivel a TA számos különböző konfigurációs állapotot vehet fel, és az állapotfejlődés alapvetően sztochasztikus, számos molekula és komplex kölcsönhatás részvételével zajlik, a statisztika és a valószínűségszámítás elméleteit alkalmazzuk a TA dinamikájának vizsgálatára. Az egyszerűség kedvéért feltételezzük, hogy a transzkripcióhoz kapcsolódó fajok, például a GTF-ek koncentrációja állandó marad a modellgén körül, és a promótert érintő molekuláris kölcsönhatások dinamikus egyensúlyban vannak. A “dinamikus egyensúly” kifejezés nem azt jelenti, hogy a molekuláris kölcsönhatások mindegyike reverzibilis; inkább csak azt követeli meg, hogy a TA egy idő után visszanyerje aktuális állapotát. A modellgén és a körülötte lévő összes faj egy rendszert alkot. A fenti feltételezések azt jelentik, hogy egy ilyen rendszer állandósult állapotban van. Tekintsünk egy statisztikai együttesre, amely nagyszámú ilyen, lényegében azonos rendszerből áll, amelyek mindegyike egymástól függetlenül fejlődik. A rendszerek száma elég nagy ahhoz, hogy a TA minden lehetséges konfigurációs állapotát lefedje ez az együttes. Vagyis minden egyes gén által átélt állapot leképezi az együttesben lévő többi gén állapotát, és az X speciális állapotban lévő gének aránya (pl. olyan gének, amelyek enhancerét aktivátorok kötik meg), P(X), az idő múlásával állandó marad. Ekvivalens módon, ha egy egyedi gént bármely időpontban megfigyelünk, annak valószínűsége, hogy a gén az X állapotban van, szintén P(X). Ebben az értelemben az, hogy egy egyedi gén melyik állapotban található, véletlen esemény.

A minimális modell (1a. ábra) esetében a TA összes konfigurációs állapotát egy univerzális Ω halmazként, a különböző, azonos kulcsjellemzőkkel rendelkező állapotokat pedig a következő részhalmazokként definiáljuk (1b. ábra). A azt jelöli, hogy az enhancerhez egy aktivátor kötődik. Az S azt jelöli, hogy a magpromótert az SCF fehérjéi kötik. M azt jelöli, hogy a naszcens mRNS a gesztorációban van (beleértve a PIC kialakulásától a Pol II elongációba való meneküléséig tartó folyamatot). J azt jelzi, hogy az enhancerhez kötött aktivátor a Mediátoron keresztül az SCF-hez, a PIC-hez vagy az OPC-hez kötődik. Mivel az eukarióta transzkripcióindítás megköveteli az SCF jelenlétét a core promóteren4,12, M⊂S. A definíciók szerint J⊂AS. Az MJ halmazban az M és az A egyidejű, azaz az enhancerhez kötött aktivátorok a Mediátoron keresztül közvetlenül befolyásolhatják a Pol II hatását. Így az aktivátorok közvetlen szabályozása alatti transzkripcióindítást az MJ halmaz írja le, míg a bazális, aktivátortól független transzkripcióindítást az M-J halmaz tartalmazza. A naszcens mRNS valószínűsége a gesztációban, azaz annak valószínűsége, hogy egy mRNS keletkezik,

ahol q a bazális transzkripciós iniciációt reprezentáló konstans, Aj pedig az A részhalmaza (a részleteket lásd a Kiegészítő információk S1 részében). Aj-ban az enhancerhez kötött aktivátorok kötelezően kapcsolatba lépnek az SCF-, PIC- vagy OPC-csatolt Mediátorral. Az (1) egyenlet jellemzi az mRNS-termelés és a TA dinamikus tulajdonságai közötti kapcsolatot.

A transzkripciós aktivátorok koncentrációjának kódolása

A promóter kromatin eltérő architektúrájához igazodva a különböző transzkripciós szakaszokban az enhancerhez kötött aktivátorok különböző funkciókat tölthetnek be, például elősegítik a hiszton acetilációt és rekrutálják a GTF-eket4,5,15. Konkrétan az Aj készlet az enhancerhez kötött aktivátorokat foglalja magában, amelyek a bazális transzkripciós gépezet kezeléséért és a transzkripció beindulásának szabályozásáért felelősek. Ráadásul ezen aktivátorok aktivitása az aktivátorok nukleáris koncentrációjának kódolásával is összefügg, mivel a az (1) egyenletben az egyetlen olyan tényező, amely az aktivátorok koncentrációjától függ. Itt az ilyen aktivátorok dinamikáját vizsgáljuk.

Az aktivátorok gyorsan mozognak a sejtmagban, és az enhancerhez való eljutásuk valószínűsége arányos a nukleáris abundanciájukkal9. Tekintsünk egy olyan időtartamot, amely alatt az Aj halmazban érintett aktivátorok m (m = 1, 2, 3, …) cikluson keresztül kötődnek az enhancerhez, majd távoznak onnan. Ezeknek az aktivátoroknak az időbeli foglaltsági rátáját RTOR -ben határozzuk meg, ahol és a j-edik ciklus kötődési és nem kötődési idejét jelöli. A magban lévő aktivátorok na fix számához

kapunk, ahol aon és aoff a kötődés, illetve a nemkötődés hajlamfüggvényei (a részletekért lásd a Kiegészítő információk S2 részét). aon a na függvénye, míg aoff független a na-tól. A (2) egyenlet azt mutatja, hogy m növekedésével a egy determinisztikus értékhez konvergál, amely a na monoton növekvő függvénye (1c-d ábra és S1 ábra; ez egy általános tulajdonság, és alkalmazható azokra az esetekre, amikor az enhancerben a kognitív kötőhelyek száma nagyobb, mint egy (lásd az S13-S18 egyenleteket)). Ez a konvergencia azt jelenti, hogy még az aktivátorok időben változó koncentrációja is kódolható az RTOR által, feltéve, hogy az aktivátorok egy időablakon belül elég gyakran ki-be ciklizálnak az enhancerre, miközben koncentrációjuk közel változatlan. Valóban léteznek olyan aktív disszociációs mechanizmusok, amelyek garantálják az aktivátorok gyors ciklikusságát9,19,20,21,22. A kötési időt a becslések szerint a másodpercek és a több tíz másodperc közötti tartományban határozták meg9,10. Sőt, az endogén CUP1 génen bebizonyosodott, hogy ez a gyors ciklikusság funkcionális10. Feltehetően az RTOR kódolja a transzkripciós aktivátorok koncentrációját. Másrészt, azon időtartam alatt, amikor az aktivátorok m-szer ciklikusan ki-be ciklizálnak az enhancerre, annak a valószínűsége, hogy az enhancert ilyen aktivátor által kötöttnek találjuk, . Mivel az együttesre vonatkozó átlaga szintén f(na), így

A megbízható transzkripciós válaszokat biztosító kényszerfeltételek

A transzkripciós események bekövetkezésének sztochasztikus volta miatt a megbízható transzkripciós válasz eléréséhez az szükséges, hogy az aktivátorok koncentrációját időben reprezentáló RTOR-kódot nagy hűséggel átvigyük a transzkriptumok mennyiségébe. Ideális esetben, ha a P(S), és mind egyenlő lenne 1-gyel, a pontos információátvitel megvalósulna. A következőkben bemutatjuk azokat a feltételeket, amelyek mellett ez a három tényező elég nagy lehet ahhoz, hogy a véletlen fluktuációk jelenlétében megbízható transzkripciós válaszokat biztosítson (az S2 és S3 ábrák intuitív magyarázatot adnak erre az alfejezetre).

A (3. egyenletből következik, hogy az aktivátorok koncentrációja nem kódolható eléggé az SCF promóteren való fennmaradása nélkül. Így az SCF-nek gyorsan kell összeállnia, amikor a kromatin architektúra lehetővé teszi, és sokkal stabilabbnak kell lennie, mint az enhancerhez kötött aktivátoroknak (I. feltétel). Az SCF ilyen stabilitását kísérletileg megfigyelték, és a TBP (TATA-kötő fehérje, az SCF központi összetevője) kötési ideje a promóteren akár 20 perc is lehet emberi sejtekben11. A esetében az Aj a J bekövetkezésének előfeltétele. Mivel az RTOR-t az aktivátorok egyedi rövid kötési ideje határozza meg, a J-nek közvetlenül az Aj bekövetkezése után kell bekövetkeznie (S3 ábra). Ellenkező esetben az RTOR-ra vonatkozó információ nagyrészt elvész, vagy akár tévesen is felhasználható a transzkripció elindításának irányítására (megjegyzendő, hogy a J az M előfeltétele). Ezért az RTOR-kód helyes átadása érdekében a Mediátornak úgy kell működnie, hogy megvárja a ciklikus aktivátorok megkötését, és az információt allosztérián keresztül továbbítja23,24,25 (II. feltétel). Ez azért van így, mert más típusú molekuláris kölcsönhatások, mint például a szabad ütközések nem tudják pontosan közvetíteni az aktivátorok kötési idejére vonatkozó információt. A Mediátor ilyen alloszterizmusát korábbi munkák26 is alátámasztják. határozza meg, hogy a J által örökölt RTOR-ra vonatkozó információ hogyan alakul át a transzkriptumok mennyiségének irányítására. Mivel az RTOR az aktivátorok szakaszos kötődésétől függ, a nagy megköveteli, hogy a rövid kötési időszakok alatt a transzkriptumok meglehetősen gyors ütemben termelődjenek (S2. ábra) (III. feltétel). Ezt a tulajdonságot a kísérleti adatok számításos becslése is igazolja (lásd a Kiegészítő információk S3 részét). Ezért mindhárom feltétel természetesen teljesíthető.

Az aktivátor-szabályozott transzkripció dinamikus mechanizmusa

A fenti három kényszerfeltétel együttesen határozza meg a TA működését. Ismételten kialakul egy olyan állapot, amelyben a Mediátor és az enhancer között egy viszonylag stabil clamp-szerű tér alakul ki (2. ábra; az I. és II. feltétel szerint). Mivel kísérletileg kimutatták, hogy az SCF nem túl stabil11 , ez a tér ideiglenesen alakul ki. A szorítószerű tér magához vonzza a szabad aktivátorokat, majd gyorsan lehámozza őket, az RTOR-t az aktivátorok koncentrációja határozza meg (a (2-3) egyenletek szerint). Amint egy aktivátor molekula bejut ebbe a térbe, a Mediátorban allosztéria keletkezik, ami a GTF-ek és más kapcsolódó fehérjék számára megkönnyített körülményeket eredményez a funkcióik elvégzéséhez. Következésképpen a Pol II-ek nagyon gyorsan képesek a transzkripciót elindítani/újraindítani (a II. és III. feltételeknek megfelelően), az RTOR pedig a transzkriptumok mennyiségét szabályozza.

Ez a mechanizmus arra utal, hogy a promótert érintő molekuláris kölcsönhatások elegáns dinamikai elveknek engedelmeskednek a következők szerint. Míg a szorítószerű tér ideiglenesen alakul ki, sokkal stabilabb, mint a benne megtelepedő aktivátorok. Az aktivátorok még rövid epizódok alatt is sokszor ciklizálhatnak be és ki a térből, amikor koncentrációjuk szinte változatlan marad; így az aktivátorok koncentrációja az RTOR által időben reprezentálható. Mivel a Mediátor az információt allosztérián keresztül továbbítja, és a transzkripció újraindulásának sebessége sokkal nagyobb, mint az aktivátorok ciklikussági sebessége, az RTOR kódot hatékonyan alkalmazzák az mRNS-szintézis irányítására. Egyszóval, a szorítószerű tér a megbízható transzkripciós válaszok strukturális alapja. Ahelyett, hogy akadályt jelentene, a molekuláris kölcsönhatások sztochasztikus jellegét teljes mértékben kihasználjuk a transzkripció megbízható indukálásához; ez nagymértékben függ a TA összetevőinek különböző mértékű, több nagyságrendet átfogó stabilitásától. A fenti érveket kísérleti adatok támasztják alá, és a tipikus időskálák a következők: a szorítószerű tér féléletideje körülbelül 5 perc11, az aktivátorok térfoglalási ideje a másodpercektől a több tíz másodpercig terjedő tartományban van10, az allosztéria általában milliszekundumoktól legfeljebb 1 másodpercig terjedő időn belül következik be23,24,25 , és a transzkriptum újraindításához mindössze néhány másodperc szükséges (lásd a Kiegészítő információk S3 részét).

A mechanizmus igazolása numerikus szimulációkkal

A javasolt dinamikus mechanizmus további igazolásához a génátírás egyszerűsített sztochasztikus modelljét építettük fel fiziológiailag reális paraméterekkel (a részleteket lásd a Kiegészítő információk S4. és S4. ábráján). Ez a modell ábrázolja a TA kulcsfontosságú állapotátmeneteit, és egyszerűen leírja a kapcsolódó kromatin dinamikáját is, ezáltal képes jellemezni a transzkripciós aktivátorokra adott transzkripciós választ. A továbbiakban a “bemenet” és a “kimenet” az aktivátorok nukleáris koncentrációját, illetve a géntermékek, az mRNS vagy a fehérje mennyiségét jelöli.

Először a sejtes mRNS-ek számának időbeli alakulását vizsgáljuk állandó bemeneti szintek mellett (3a. ábra). Figyelemre méltó, hogy az mRNS-ek burst-szerű módon termelődnek, ami összhangban van az uralkodó nézettel14,27,28,29,30,31,32. Alacsony szintű bemenetek esetén az egyik allél átíródik, míg a másik néma egy diploid sejtben, és így a bursting jelenség nyilvánvaló. Magas szintű bemenetek esetén azonban mind a két allél gyakran robban, így az összeg majdnem állandóvá válik. Ez arra utal, hogy a tartósan emelkedett transzkripciós válaszok fenotípusa magas bemeneti szinteknél figyelhető meg14.

Egy nemrégiben végzett kísérleti elemzés kizárta annak lehetőségét, hogy a kromatin környezete központi szerepet játszik a transzkripciós kitörés alakításában32. Itt azt mutatjuk be, hogy a transzkriptek kitörése a Pol II-ek tartós újraindításából ered, amikor a clamp-szerű teret az aktivátorok elfoglalják (4. ábra). Vagyis az mRNS iniciálása maga is burst-szerű. A kitörés nem puszta zaj, hanem az aktivátorok koncentrációját jelentő és az mRNS-termelődést irányító RTOR-kód közvetlen megnyilvánulása.

Második lépésként a transzkripciós válasz átlagos input/output viszonyát vizsgáljuk. Az átlagos kimenet a bemenet Hill-függvényéhez hasonlít, amelyet a rendszerbiológiában széles körben használnak a génexpresszió modellezésére3,33,34 (3b. ábra). A kimenet standard eltérésének SDout görbéje a bemenethez képest megközelítőleg harang alakú (3c. ábra). A belső zaj intenzitása, amelyet az SDout és az átlagos kimenet35 hányadosaként határozunk meg, fordítottan korrelál a bemenettel (a 3b. ábra betétje). A fenti jellemzők ráadásul érzéketlenek a bemenet enyhe ingadozásaira (azaz az extrinsic zajra) (S5. ábra), ami a transzkripciós válasz zajjal szembeni robusztusságára utal. Mindezek az eredmények jó összhangban vannak a Saccharomyces cerevisiae36 és a Drosophila embriókban37 végzett kísérleti mérésekkel. Különösen az SDout görbe bal oldala alacsonyabb, mint a jobb oldala; ez a jellemző szinte kvantitatív módon összhangban van a kísérleti adatokkal37 (további megbeszéléseket lásd a Kiegészítő információk S5 részében). Ezzel szemben a fent javasolt dinamikai elvektől való eltérések (beleértve azokat a körülményeket, amikor az aktivátorok ciklikussága lassú, az állványkomplexum/klámpaszerű tér nem stabil, vagy/és a transzkripciós újraindulás sebessége alacsony) csökkentenék a TA azon képességét, hogy megbízhatóan reagáljon a bemenetre (S6. ábra).

A Drosophila-embriókban megfigyelt bemenet-kimenet kapcsolatról úgy vélték, hogy a molekuláris kölcsönhatások határértékének maximális kihasználásával valósul meg37,38,39. Az ilyen mikroszkopikus kölcsönhatások tulajdonságait úgy integrálják, hogy makroszkopikusan SDout formájában nyilvánuljanak meg. Az SDout görbe összességében még mindig harang alakú az SDin görbéhez képest (vö. 1d. ábra). Ez azt jelenti, hogy az RTOR-kód aláírása közvetlenül átvihető a kimenetre. Ez megerősíti, hogy az aktivátorok időbeli foglaltsági rátáját valóban kihasználják a transzkripció szabályozására, és a Mediátor az információt allosztérián keresztül továbbítja. Másrészt az SDout görbe aszimmetrikus, a jobb oldal magasabb, mint a bal. Ennek oka nyilvánvaló. Ha a bemenet nagyon magas, az enhancer szinte végig az aktivátorok által kötött, és így az ingadozások elsősorban az SCF dinamikus tulajdonságait és a Pol II-ek általi transzkripciós újraindítást tükrözik. További szimulációink azt mutatják, hogy az SDout görbe jobb oldala csökken az SCF stabilitásának vagy a transzkripciós újraindítás sebességének növelésével; csak akkor válik a görbe szimmetrikussá, ha ezek erősségét a fiziológiás tartományokon túlra növeljük (S6F ábra). Ez is igazolja, hogy mind a P(S), mind a valóban elég nagy. Az SDout tulajdonságainak tehát egyértelműen bizonyítaniuk kell a mikroszkopikus transzkripciós mechanizmust.

Harmadszor, az mRNS-szintek eloszlását vizsgáljuk az azonos bemenetnek kitett nagy sejtpopulációban (3d. ábra). Kis bemenetek esetén a bursting jelenség különösen szembetűnő, és a legtöbb sejtben nincs vagy kevés mRNS található. Ez összhangban van a kísérleti megfigyelésekkel27,30,31. Az eloszlás azonban a bemenet növekedésével fokozatosan normalizálódik. Aon/aoff >1 esetén az eloszlás a bemenet növekedésével élesebbé válik. Ezek az eredmények kísérleti azonosításra várnak.

Negyedszer szimuláljuk a periodikusan változó bemenetre adott transzkripciós választ. A mikroszkopikus folyamat a promóteren meglehetősen dinamikus és sztochasztikus, a TA különböző komponensei eltérő stabilitást mutatnak (3e. ábra). Az mRNS-ek mennyisége azonban követheti a bemenetet. Ezek az eredmények jó összhangban vannak a FRAP által feltárt eredményekkel, azaz a TA egy rendkívül dinamikus apparátus8,10,11,22. Másrészt a kromatin immunprecipitációs próbák (ChIP) szimulációi, amelyek a promóter különböző állapotai eloszlásának időbeli alakulását jellemzik egy sejtpopulációban, erős szabályosságot mutatnak az eloszlásokban (3f. ábra). Mind az enhancerhez kötődő aktivátorok, mind a promóterhez kötődő SCF és Pol II mintázata követi a bemenetet. Az mRNS-transzkriptumok a bemenettel fázisban keletkeznek, míg a hisztonok fordított fázisban foglalják el a promótert. Mindezek az eredmények jól összhangban vannak a kísérleti eredményekkel22,40. Ezért a FRAP- és ChIP-kísérletek eredményei között megfigyelt eltérések a mérések során alkalmazott eltérő felbontásból eredhetnek. A ChIP mérések a molekuláris kölcsönhatásokat mind időben, mind a sejtpopuláció egészére vonatkozóan integrálják, míg a FRAP szorosabban tükrözi a pillanatnyi kölcsönhatásokat. Továbbá, az időben változó bemenetre adott transzkripciós válasz robusztus az extrinsic zajjal szemben, de érzékeny az összetett bemeneti jelekre, és a dinamikus alapelvektől való eltérések (mint például az aktivátorok alacsony ciklikációs sebessége, az instabil állványkomplexum/clamp-szerű tér, vagy/és a transzkripciós újraindulás alacsony sebessége) csökkentenék a válaszképességet (lásd az S7 és S8 ábrákat).