Az emberben nyugalmi állapotban percenként körülbelül 5-8 liter levegő áramlik be és ki a tüdőből. A levegő oxigén- és CO2-koncentrációja változhat, allergéneket hordozhat, és a légutak és a gázcserélő felületek különböző mértékű mechanikai megnyúlását adja. Ezeket a jeleket érzékelik, továbbítják és feldolgozzák olyan fiziológiai kimenetekké, mint a pulmonális vérnyomás, az immunválaszok és a légzési ritmus szabályozása, de a mechanizmus nem világos. A pulmonális neuroendokrin sejtek (PNEC) a halaktól az emlősökig az élőlények széles skáláján megtalálhatók (1). Az emlősök tüdejében a PNEC-k az egyetlen innervált légúti hámsejtek, és a teljes tüdőhámsejt-populáció kevesebb mint 1%-át teszik ki (2). Bár in vitro bizonyítékok szerint a PNEC-k szerepet játszanak az oxigénérzékelésben, a hörgő- és érrendszeri simaizomzat tónusában és az immunválaszban (1, 3), ezeket a szerepeket in vivo nem sikerült bizonyítani. Egy nemrégiben végzett vizsgálat kimutatta, hogy a PNEC-ek genetikai ablációja felnőttekben nem veszélyeztette a homeosztázist vagy a légutak helyreállítását, így kérdéses e sejtek in vivo fontossága (4). A PNEC-kórképeket, különösen a PNEC-szám növekedését számos tüdőbetegségben dokumentálták, beleértve az asztmát, a bronchopulmonális diszpláziát, a cisztás fibrózist, a krónikus obstruktív tüdőbetegséget, a veleszületett rekeszsérvet, a csecsemőkori neuroendokrin hiperpláziát, a hirtelen csecsemőhalál szindrómát és a pulmonális hipertóniát (5-8). Minden esetben tisztázatlan, hogy a PNEC növekedése a tünetek oka vagy következménye-e.

Egerek tüdejében a legtöbb PNEC ~3-20 sejtből álló, neuroepithelialis testeknek (NEB) nevezett csoportokban található (3, 9). Mind a szoliter, mind a klaszteres PNEC-k sűrű magvavezikulákat tartalmaznak, amelyek tele vannak bioaktív neuropeptidekkel, például kalcitonin génnel kapcsolatos peptiddel (CGRP) vagy aminokkal, például szerotoninnal (1). Ezek ingerekre, például az oxigénszint változására reagálva szabadulnak fel. A neuropeptideket és aminokat néhány, a PNEC-ekkel azonos folyamatba vonták be (10-12), ami felveti annak lehetőségét, hogy ezek közvetíthetik a PNEC működését. Az ok-okozati összefüggést azonban in vivo nem bizonyították.

A jelenlegi vizsgálatot azért kezdeményeztük, hogy feltárjuk a veleszületett rekeszsérv (CDH), egy olyan születési rendellenesség hátterében álló mechanizmusokat, amely jelentős tüdőműködési zavarokkal jár, beleértve a fokozott immunválaszt és a pulmonális hipertóniát (13). A CDH genetikai egérmodelljében felfedeztük a sikertelen PNEC-klasztereződés hibáját. Ezt egy eseménysorozat követi: a PNEC neuropeptidek növekedése, az immuninfiltrátok növekedése és a tüdő szerkezetének átalakulása. Ezek az eredmények a PNEC működésének in vivo demonstrációját kínálják. Mivel a PNEC számában és a kapcsolódó neuropeptidekben bekövetkező változásokat számos tüdőbetegségben dokumentálták, eredményeinknek a CDH-n túl is széleskörű következményei vannak.

Az emberekben a körkörös receptor (ROBO) gének mutációit összefüggésbe hozták a CDH-val (13, 14). A CDH-hoz társuló tüdődefektusok tanulmányozására a Robo1-et és a Robo2-t is inaktiváltuk az endodermából származó epitéliumban, beleértve a tüdőt is, Shhcre (a továbbiakban Shhcre;Robo mutáns) segítségével egerekben (15, 16). Bár ezek a mutánsok túlélnek, a posztnatális nap (P) 15-től kezdve csökkent gázcsere-felületet mutatnak (1. ábra, A és B, valamint S1 ábra). A gázcsere-felület csökkenése előtt, P7-ben végeztük el a microarray-t, majd a kvantitatív reverz transzkriptáz-polimeráz láncreakciót (qRT-PCR). A 20 legjobban differenciálisan expresszálódó gén közül tizenötöt immunválaszban érintettek, és mindegyik szignifikánsan megnövekedett, beleértve a Ccl3, Cxcl2, Tnfa és Saa3 gént (1C ábra). Ezzel a szignatúrával összhangban az immunsejtek, köztük a neutrofilek, eozinofilek, makrofágok és T-sejtek megnövekedett számát figyeltük meg (1. ábra, D és E, valamint S2 ábra). Továbbá az M2 makrofágok arányának növekedése és az M1 makrofágok arányának csökkenése figyelhető meg (S3 ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a Shhcre;Robo mutánsok fokozott immunérzékenységet mutatnak, ami egy gyakori CDH-komorbiditást utánoz (13).

Noha a Robo a tüdő mesenchimájának alveoláris régiójában expresszálódik (S4. ábra), a hámban való expressziója a légutak mentén ritka sejtekre korlátozódik (1F. ábra). A CGRP-antitesttel való kolábálás kimutatta, hogy a Robo-t expresszáló epitélsejtek PNEC-ek (1G ábra). Annak megerősítésére, hogy a Robo génekre a PNEC-eken belül van szükség a működéshez, inaktiváltuk a Robo-t Ascl1creERT2 (17), egy knock-in cre driver segítségével, amely PNEC-specifikus aktivitást kölcsönöz a tüdőepithelben (S5 ábra). Azt találtuk, hogy az Ascl1creERT2;Robo mutánsok mind az alveoláris egyszerűsödést, mind a makrofágok elszaporodását mutatták, ami a Shhcre;Robo fenotípusokat ismételte meg (S6. ábra). Ezek az eredmények együttesen azt mutatják, hogy a Robo specifikusan szükséges a PNEC-ekben az immunsejtek számának korlátozásához és az alveoláris egyszerűsödés megakadályozásához.

A 13,5. embrionális napon (E) az újonnan meghatározott PNEC-ek szoliter sejtek voltak mind a kontroll, mind a Shhcre;Robo mutáns tüdőben (2. ábra, A és B). E15,5-re a kontrollban a PNEC-ek többsége NEB-kbe aggregálódott. A Shhcre;Robo mutánsokban azonban a PNEC-ek nem csoportosultak (2. ábra, C és D). Ez az erősen penetráns fenotípus a posztnatális tüdőben is fennmaradt (2. ábra, E és F, valamint S7 ábra). A PNEC sejtek teljes száma érintetlennek tűnik, amit az Ascl1 és más PNEC markerek normális expressziója is alátámaszt (S8 ábra). A mutánsban a nem klaszterezett sejtek elveszítik ék alakjukat, és kerekebbek (S7. és S9. ábra). Továbbá, ellentétben a kontrollokkal, ahol a szoliter PNEC-ek nem innerváltak (9), a mutánsban a nem klaszterezett PNEC-ek ~33,3%-a (93 sejtből 31) innervált (2F ábra és 7. ábra). S9), ami arra utal, hogy a PNEC innervációja nem függ a klaszterképződéstől vagy a Robo funkciótól a PNEC-kben.

Ascl1creERT2;Robo mutánsoknál is megfigyelhető a PNEC-k klasztereződése (S10 ábra). Ez a fenotípus akkor is megnyilvánult, amikor a Robo inaktiválását posztnatálisan indukáltuk, ami a NEB kialakulását követően következett be. Eredményeink együttesen megállapítják, hogy a Robo szükséges a PNEC összeépüléséhez és fenntartásához a NEB-kben.

A Robo működhet ligandjától, a Slit-től függően vagy függetlenül (18). A Slit mutánsok elemzése azt mutatja, hogy míg a PNEC-klasztereződés egyetlen mutánsban sem sérül, a Slit1;3 mutánsokban csökken (S11 ábra, A-D). Ez az eredmény arra utal, hogy a Robo funkciója ebben a folyamatban valószínűleg ligandfüggő.

A Slit és a Robo elsősorban a sejtszintű taszítást és ritkán a vonzást közvetíti (19). Annak meghatározására, hogy a Slit taszító vagy vonzó jelként hat-e a Robo-kifejező PNEC-ek számára, először meghatároztuk, hogy hol fejeződnek ki a Slit-gének. A kombinált Slit1;2-GFP (zöld fluoreszcens fehérje) riporter a nagy NEB-ken belül csak körülbelül 1-3 PNEC-ben mutatott expressziót, ami felveti annak lehetőségét, hogy a Slit1/2-expresszáló sejtek lehetnek a klaszter nukleáló sejtjei (S11E ábra). Ez szintén PNEC-szubspecializációra utal a klaszteren belül. A Slit3 expressziója az artériákat körülvevő érrendszeri simaizomsejt-rétegre korlátozódik, amely a főhörgők mentén halad, ahol a legtöbb NEB található (S11. ábra, F és G). A Slit-expresszáló sejtek és a Robo-expresszáló PNEC-ek közelsége együttesen felvetette annak lehetőségét, hogy a Slit ligandumok vonzó jelzést adhatnak a PNEC-ek számára.

Ezek teszteléséhez áramlási citometriával kiválogatott GAD1-GFP+ PNEC-eket vetettünk egy Boyden-sejtmigrációs tenyészbetét felső kamrájába. Amikor Slit fehérjét adtunk a felső kamrában lévő sejtekhez, ~52%-kal kevesebb (P = 8,5 × 10-4) PNEC vándorolt az alsó kamrába (S12 ábra, J-I). Ezzel szemben, amikor Slit fehérjét adtunk az alsó kamrába, 18%-kal több (P = 7,5 × 10-5) PNEC vándorolt az alsó kamrába (S11. ábra, L-N). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a Slit-Robo hajtja a PNEC-ek NEB-kbe történő csoportosulását, valószínűleg a sejtek vonzása révén.

A PNEC-ek és az immunválasz közötti lehetséges kapcsolat tesztelésére megvizsgáltuk a PNEC-ek által termelt neuropeptidek expresszióját (1). A kilenc vizsgált neuropeptid génből öt szignifikánsan felszabályozott volt a Shhcre;Robo mutánsokban (3A ábra). A CGRP elleni antitesttel történő festés kimutatta, hogy bár a mutáns PNEC-ekben megmarad az expressziója, a festődés intenzitása megnövekedett, és már nem korlátozódik e sejtek bazális oldalára (S7. és S9. ábra). Megjegyezzük azt is, hogy míg a klaszterek feloldása E15,5-re bekövetkezett, a neuropeptidek felszabályozódása csak a születés után figyelhető meg, feltehetően a levegővel való érintkezést követően (S12 ábra).

Azért, hogy meghatározzuk, hogy a neuropeptidek növekedése hozzájárul-e az immunválaszhoz, a CGRP-re összpontosítottunk, mivel annak transzkriptje mutatja a legnagyobb növekedést az összes vizsgált közül (3A ábra). Ezt a növekedést a Cgrp mutáns alléljának Shhcre;Robo-háttérbe történő nemesítésével ellensúlyoztuk (20). A Robo kontrollokban a Cgrp elvesztése nem változtatta meg a makrofágok számát (3. ábra, B, D és F). A Shhcre;Robo mutánsokban azonban a Cgrp elvesztése dózisfüggő módon jelentősen csökkentette a makrofágok számát (3. ábra, C, E és F). Azt is megállapítottuk, hogy a Cgrp elvesztése részben visszafordította az alveoláris egyszerűsödés fenotípusát (S13 ábra). Megjegyezzük, hogy sem a makrofágok növekedését, sem az alveoláris egyszerűsödést nem sikerült teljesen megakadályozni, ami arra utal, hogy az egyéb neuropeptidek növekedése hozzájárulhat a downstream eredményekhez. Ezek az eredmények együttesen in vivo genetikai bizonyítékot szolgáltatnak arra, hogy a neuropeptidek közvetítik a PNEC működését.

Mivel a normális alveologénezis P4-ben kezdődik (21), az alveoláris egyszerűsödés késői, P15-ös megjelenése arra utal, hogy az alveologénezis zavara nem lehet elsődleges ok. Bár P10-re nem észleltünk változást a sejthalálban, egyértelműen csökkent az elasztin (S14 ábra), ami az egyszerűsödés egyik lehetséges kiváltó oka (22). Az immunsejtek, például a makrofágok olyan mátrix metalloproteinázokat expresszálnak, amelyek lebontják az elasztint (23). Továbbá a makrofágok számának növekedése az egyszerűsödés előtt figyelhető meg (S1 és S2 ábra), ami felveti az okozati összefüggés lehetőségét. Ennek tesztelésére Shhcre;Robo és kontroll tüdőt kezeltünk klodronáttal, egy hidrofil gyógyszerrel, amely a makrofágokat kimeríti (24). A P5-ben, az immunsejtek növekedése előtt kezdődő kezelés hatékonyan korlátozta az alveoláris makrofágok számát a kiindulási szintre a Shhcre;Robo mutánsokban (4. ábra, A-E). Ez mérsékelte az elasztin csökkenését és teljesen megakadályozta az egyszerűsödést (4. ábra, F-J, és S15 ábra). Ezek az adatok együttesen in vivo bizonyítják, hogy a megnövekedett immuninfiltráció felelős az alveoláris egyszerűsödésért, és hogy mindkettő a PNEC diszfunkció downstream következménye.

Ebben a tanulmányban in vivo genetikai bizonyítékokat mutatunk be, amelyek bizonyítják, hogy a PNEC-k ritkaságuk ellenére mélyreható hatással vannak a posztnatális tüdőfunkcióra. Bár a PNEC-defektus már E15,5-ben nyilvánvaló a Shhcre;Robo mutánsban, a neuropeptidek felszabályozásával kezdődő élettani következmények a születés után kezdődnek. Ez arra utal, hogy a PNEC hatása a tüdő levegőnek való kitettségétől függ. Eredményeink tehát a jelátvitel olyan módját vázolják fel, amelyben a PNEC-ek érzékeny reosztátok a légúti falon, amelyek a környezeti jeleket nem sejt-autonóm módon immunválaszokká alakítják.

Eredményeink a Robo1,2-t a PNEC-ek NEB-ekbe való csoportosulását szabályozó génkészletként határozzák meg. Bemutatjuk továbbá a Slit és a Robo-t, mint az emlősök szervének epitéliumában történő szelektív sejtválogatás szereplőit. A Robo inaktiválása a NEB kialakulása után szintén a klaszteresedés feloldásához vezetett, ami arra utal, hogy a klaszterek aktívan fennmaradnak. Bár a Slit-Robo nagyrészt arról ismert, hogy a sejtek taszítását közvetíti, adataink arra utalnak, hogy a PNEC klasztereződését a sejtek vonzásán keresztül irányítják. A Robo inaktiválása megváltozott innervációhoz és a neuropeptidek bazális-biális lokalizációjának elvesztéséhez vezetett. Ezek a változások állhatnak a PNEC-ek megváltozott downstream hatásának hátterében.

A PNEC-ek számának növekedését a tüdővel kapcsolatos betegségek széles skáláján dokumentálták, a ritka rendellenességektől, mint a CDH, az olyan gyakori állapotokig, mint az asztma (5-8). Megjegyezzük, hogy a Robo mutáns PNEC fenotípusa különbözik a PNEC-szám növekedésétől. Mindkettő azonban megnövekedett neuropeptidekkel jár együtt, amelyekről kimutattuk, hogy a PNEC-funkció hatásos effektorai. Eredményeink ezáltal azt jelzik előre, hogy a dokumentált PNEC-patológiák és neuropeptid-emelkedések a betegség passzív leolvasása helyett a légzőszervi betegségek széles skáláján a tünetek aktív tényezői lehetnek.

.