A sperma minőségének javítása hiperviszkózus spermában DNase I kezelést követően
Abstract
A sperma hiperviszkózussága rontja a spermiumok mozgékonyságát és férfi meddőséghez vezethet. E prospektív vizsgálat célja annak felmérése volt, hogy az exogén DNáz képes-e javítani a sperma minőségét, figyelembe véve, hogy a DNáz számos faj ondóplazmájában megtalálható, és hogy a neutrofilek kromatint szabadítanak fel a baktériumok csapdába ejtése érdekében. Az elemzés során összesen hetvenhét, magas szeminális viszkozitású (HSV) spermamintát mint vizsgálati csoportot és hatvankét, normál szeminális viszkozitású (NSV) spermamintát mint kontrollcsoportot hasonlítottak össze. Ezeket az ondómintákat három csoportra osztottuk, amelyeket (a) DNáz I-vel 37°C-on 15 percig, (b) sűrűséggradiens centrifugálással és (c) a fenti két módszer kombinációjával kezeltünk. A hiperviszkózus sperma tizenöt perces kezelését követően az ondóminták 83%-ában statisztikailag szignifikáns mértékben nőtt a spermiumok motilitása. Ezzel szemben a normál viszkozitású sperma DNáz-kezelése nem járt ilyen hatással. A fenti kezelést a normális spermiumok százalékos arányának jelentős növekedése is kísérte, ami a teratozoospermia index jelentős csökkenését eredményezte. A DNáz I kezelést követő sűrűséggradiens centrifugáláson átesett spermaminták és a csak sűrűséggradiens kezelés után gyűjtött minták összehasonlítása azt mutatta, hogy az első esetben az eredmények látványosabbak voltak. Az egyes készítmények értékelése a hozam szempontjából (a kezelést követő összes progresszíven mozgékony spermiumszám %-ban a kezdeti összes spermiumszámhoz viszonyítva) azt mutatta, hogy a kombinált megközelítés 29,8%-ot eredményezett, szemben a csak sűrűségkezeléssel kapott 18,5%-kal (p=0,0121). A DNáz I kezelés a spermiumok motilitásának és morfológiájának javulását eredményezi, és előnyös lehet a hiperviszkózus spermával rendelkező férfiak számára az asszisztált reprodukciós protokollokban.
1. Bevezetés
Tanulmányok dokumentálták, hogy a sperma hiperviszkozitása (SHV) az ejakulátumok 12-29%-ában fordul elő . Az SHV olyan állapot, amely férfi meddőséget eredményezhet , mivel súlyosan ronthatja az ondófolyadék fizikai és kémiai jellemzőit . Ez összefüggésbe hozható a spermiumok csökkent mozgékonyságával, valamint az in vitro megtermékenyítés rossz eredményével és a reaktív oxigénfajok (ROS) fokozott termelésével. Továbbá az ondó oxidatív károsodást okozó termékek szintje szignifikánsan korrelált az ondófolyadék viszkozitásával terméketlen férfiaknál .
Erős jelek utalnak arra, hogy léteznek olyan gátló utak, amelyek rontják a sperma minőségét a ROS termelésén keresztül a spermiumoknak a férfi nemi szerveken keresztül történő szállítása során , a spermiumok laboratóriumi kezelése és tárolása során bekövetkező károsodására utalnak , de arra is , hogy az ejakulációt követően “automatikusan” további ROS termelődik, legalábbis az ondó hiperviszkozitás egyes eseteiben . Ez az állapot többnyire a férfi járulékos nemi mirigyek fertőzésével és varicocelével hozható összefüggésbe , bár a patofiziológia még mindig nem teljesen tisztázott. Továbbá az ondófolyadék antioxidáns kapacitásának csökkenését mutatták ki oligoasthenozoospermiás mintákban az ondó hiperviszkozitás eseteiben . Ezenkívül a túlzottan generált ROS-szintek lipidperoxidációt idéznek elő, ami megzavarja a membránmorfológiát . A leukociták megnövekedett szintjének jelenléte az ondóban összefügg az SHV-vel . Ezenkívül a leukociták a ROS és a retrovírusok vektorainak fő forrása a spermában , míg jelenlétük a fogamzás valószínűségének csökkenésével, valamint a méhen belüli megtermékenyítés (IUI) és a hagyományos IVF alacsonyabb sikerességi arányával hozható összefüggésbe. Továbbá az SHV összefügg az ondó mikrobióta összetételével és a patogén baktériumok magasabb prevalenciájával .
Az SHV-sperma viszkozitásának csökkentésére számos terápiás megközelítést javasoltak. A túlhidratálás és a prosztatamasszázs nem volt hatékony . A sperma kíméletes aspirálása és kilökése 5 ml-es fecskendőn keresztül szinte hatástalan, mivel az SHV nem mechanikus jelenség . A kimotripszin alkalmazásával végzett proteolízis javítja a hiperviszkózus sperma kezelését, bár a spermiumok fehérjéiben némi változás következik be . Figyelembe véve, hogy egy ilyen eljárás károsíthatja a spermiumok szerkezetét, és hogy a legtöbb esetben az SHV leukocitospermiával korrelál , feltételeztük, hogy az SHV-t a neutrofil extracelluláris csapdák (NET-ek) okozzák, és hogy ezek érzékenyek a DNS DNáz I általi lebontására. Legjobb tudomásunk szerint ez az első jelentés a DNáz I használatáról, az SHV kezelésére.
2. Anyagok és módszerek
2.1. Résztvevők
A prospektív vizsgálatot 3 éven keresztül végeztük az athéni Orvosi Klinika, Locus Medicus meddőségi anamnézisű betegein, a következő kizárási kritériumokkal: varicocele hypogonadismus, cryptorchidismus és az ondóvezetékek veleszületett elzáródása. Hetvenhét HSV-vel fertőzött spermamintát nyertek a vizsgálati csoportként, és hatvankét NSV-vel normális spermamintát nyertek a kontrollcsoportként, az alábbiak szerint rétegezve. Kezdetben harminckét HSV-s és tíz NSV-s spermamintát DNase I-vel kezeltünk. Továbbá egy másik, huszonhat HSV-s és ötvenkét NSV-s spermamintát sűrűséggradiens centrifugációs (DGC) módszerrel dolgoztunk fel. Végül tizenkilenc HSV-mintát a módszerek kombinációjával dolgoztak fel, azaz először DNáz I-vel, majd DGC-vel kezelték. Minden résztvevő aláírta a tájékoztatáson alapuló beleegyező nyilatkozatot, mielőtt részt vett volna a vizsgálatban.
2.2. Spermaelemzés
A 3-5 napos szexuális absztinencia után maszturbációval nyert spermamintákat steril tartályokba helyezték. A gyűjtés után a spermamintákat 37°C-on hagyták elfolyósodni, majd a fent leírt kombinált eljárás előtt és után hagyományos analízisnek vetették alá a spermaelemzés referenciahatárait]. A motilitást ugyanaz a hivatalosan képzett (ESHRE) biológus értékelte, aki nem vesz részt a vizsgálatban. A fehérvérsejtek (WBC) jelenlétét peroxidáz teszttel (Leukoscreen FertiPro; Belgium) értékeltük a WHO 2010-es iránymutatásai szerint . Bár a viszkozitást kvantitatív viszkoziméterrel lehetett értékelni, a sperma viszkoelaszticitását olyan eldobható műanyag pipetták segítségével becsültük meg, amelyek lehetővé tették a sperma gravitáció általi csepegését, és megfigyeltük az esetleges szálak hosszát. Azokat a férfiakat, akiknek a spermája 2 cm és 4 cm közötti szálhosszúságú volt, enyhe SHV-nek (53,12%), a 4 cm és 6 cm közötti szálhosszúságot (40,62%) mérsékelt SHV-nek, a 6 cm-nél nagyobb szálhosszúságot pedig súlyos SHV-nek (6,25%) minősítették, a magas viszkozitású csoportba (HV) sorolták, míg a viszkoelaszticitást normálisnak tekintették, ha a szálhosszúság 2 cm vagy annál kisebb volt .
2.3 . Enzimes kezelés
A DNase I hatását normál és nagy viszkozitású spermamintákban értékeltük. A cseppfolyósítást követően a DNáz I-et óvatosan 20 U/ml végkoncentrációban a steril tartályba húztuk a spermamintával együtt, és folyamatosan kevertük, majd 37 °C-on 15-60 percig inkubáltuk. A fenti spermaminták motilitását és morfológiáját az enzimatikus emésztés előtt és után elemeztük, és meghatároztuk a PR % (az összes spermiumszám (a+b) %-ának motilitása) spermiumok arányát bármilyen kezelés előtt (azaz a kezdeti PR %).
2.4. A spermiumok mozgékonyságát és morfológiáját az enzimatikus emésztés előtt és után vizsgáltuk. Sperma előkészítés
A sűrűséggradiens centrifugálási (DGC) módszert a gyártó ajánlásainak megfelelően végeztük. A sűrűséggradienst úgy készítettük el, hogy 1 ml 40%-os tápfolyadékot rétegeztünk a 80%-os PureSperm® (Nidacon International, Göteborg, Svédország) tápfolyadékra egy 15 ml-es kúpos centrifugacsőben. A spermát a gradiens tetejére rétegeztük, és 300 g-nél 20 percig centrifugáltuk. A centrifugálás mértéke és erőssége a minta minőségétől függően változtatható: például a centrifugálási idő növelhető a nagy viszkozitású minták esetében. A centrifugálást követően a felülúszó nagy részét óvatosan el kell távolítani, a pelletet pedig egy új, tiszta csőbe kell helyezni, és jól reszuszpendálni 5 ml közegben a sűrűséggradiens közeg eltávolítása érdekében. Ezután 10 percig 200 g-nél pörgetjük, a felülúszót eltávolítjuk, és a végleges pelletet az asszisztált reprodukciós technológiákhoz (ART) használt steril közegbe reszuszpendáljuk. Végül a kombinatorikus kezelés során a nagy viszkozitású mintákat először DNáz I-vel kezelték, majd a fent leírt DGC-módszerrel készítették elő. Meghatározták a koncentrációt, a motilitást és a morfológiát a preparálás előtt és után.
Figyelembe véve, hogy a mosás utáni összes progresszívan mozgékony spermiumszám (TPMSC) hasznos lehet az intrauterin inszemináció hatékonyságának előrejelzésében, az egyes módszerek hozamát is a következőképpen értékelték: a TPMSC százalékos arányát a DGC preparátummal vagy DNáz I-vel, illetve a kombinált DNáz I kezelés és azt követő DGC preparálás után elosztották a kezelés előtti összes spermium számával. Ezen túlmenően a hozam eredményét (azaz a végső PR %-ot/az összes spermiumot megelőzően) összehasonlítottuk a kezelés előtti kezdeti PR %-kal/az összes spermiummal. A hozamot a magas vagy normál viszkozitású spermaminták esetében értékelték. Bár nincs konszenzus a beadott mozgékony spermiumok számát illetően az ART-ben , általánosan elfogadott, hogy a mozgékony spermiumok maximális számának visszanyerése minden egyes spermamintából bármilyen kezelést követően nagy jelentőséggel bír.
2.5. Statisztikai elemzés
Az adatokat egyirányú ANOVA-val elemeztük, amelyet többszörös összehasonlító Kruskal-Wallis teszt követett a GraphPad Prism 6.0 segítségével. A 0,05-nél kisebb p-értéket tekintettük statisztikailag szignifikánsnak.
3. Eredmények
A fehérvérsejtek (WBC) koncentrációját az 1. ábra mutatja. Az összes csoport között statisztikailag szignifikáns különbség van (p=0,0238 egyirányú ANOVA). Továbbá a HV csoporton belül a statisztikai különbség 0,0018.
A WBC koncentrációja (106/ml) a viszkozitás szálhossza szerint (enyhe, közepes és súlyos), mint a HV csoport; w/o V: viszkozitás nélküli sperma.
A DNase I alkalmazása növeli a spermiumok motilitását a nagy viszkozitású férfiaknál (32 alany). Amint a 2. a) ábra mutatja, az enzim tizenöt percen keresztül történő hozzáadása (t=15) javítja az (a) mozgás százalékos arányát 2,875% spermiumról 8,094% spermiumra közvetlenül a cseppfolyósítás után (t=0), ami statisztikailag szignifikáns (p=0,049, többszörös összehasonlító teszt). Ezenkívül a PR mozgása ugyanezen időpontok között 27,468%-ról statisztikailag szignifikánsan 46,59%-ra emelkedett (p<0,0001, többszörös összehasonlító teszt). Ugyanakkor a (c) frakció mozgékonysága 34,687%-ról (t=0) 21,5%-ra (t=15) csökkent (p<0,0001, többszörös összehasonlító teszt), míg a (d) frakció mozgékonysága 37,812%-ról (t=0) 31,968%-ra (t=15) (p=0,45 többszörös összehasonlító teszt). A DNase I használata a normál viszkozitású spermában nem növeli a spermiumok motilitását statisztikailag szignifikáns módon, egyik mintában sem, amint azt a 2. b) ábra mutatja.
(a)
(b)
(a)
(b)
A DNáz I hatása a spermiumok motilitására 15 perc DNáz I-vel történő inkubáció után. A DNáz I statisztikailag szignifikáns módon javítja a PR mozgást a hiperviszkózus spermában (a), de nincs hatása a normál viszkozitású spermiumokra (b). w/o: sperma kezelés nélkül, kezelt: DNáz I-vel kezelt sperma, a: gyorsan progresszív spermiumok, b: lassan progresszív spermiumok, c: nem progresszív, d: immotilis, és PR: motilitás (a+b).
Az inkubáció további tizenöt perccel történő folytatása (32-ből 21 alany esetében) (összesen harminc percig, t=30) a spermiumok egy részének motilitását 1,761%-ról (t=0) 9,524%-ra (t=30) növelte (p=0,046, többszörös összehasonlító teszt), amint azt a 3. ábra mutatja. Érdekes módon a PR-mozgás drámaian javult a spermiumok 24%-áról (t=0) 45,047%-ra (t=30) (p<0,0001, többszörös összehasonlító teszt). A spermiumok (c) és (d) frakciójának mozgékonysága statisztikailag szignifikánsan csökkent 35,714%-ról 22,08%-ra (p=0,001, többszörös összehasonlító teszt), illetve 40,238%-ról 32,238%-ra (p=0,039, többszörös összehasonlító teszt). A spermiumok viszkozitásának újraértékelése a DNáz I kezelés után azt mutatta, hogy a legtöbb esetben a viszkozitás normalizálódott vagy legalábbis javult.
A DNáz I hatása a hiperviszkózus sperma motilitására 30 perces DNáz I-vel történő inkubáció után. A DNáz I statisztikailag szignifikáns módon javítja a mozgást a hiperviszkózus spermában, de kevésbé látványos módon, mint a tizenöt perces inkubáció. w/o: sperma kezelés nélkül, kezelt: DNáz I-vel kezelt sperma, a: gyorsan progresszív spermiumok, c: nem progresszív, d: immotilis, és PR: motilitás (a+b).
Ezután összehasonlítottuk a DNáz I kezelés után sűrűséggradiens centrifugáláson átesett spermiumok eredményeit a csak sűrűséggradiens kezelés után kapott eredményekkel. A mintakorlátok miatt a két eljárást nem ugyanazon alanyoktól származó mintákon alkalmaztuk, hanem különböző alanyoktól származó mintákon, amelyek spermiumainak viszkozitása magas volt. A sűrűséggradiens centrifugálási kezelést intrauterin inszemináció (IUI) esetén is alkalmazták. Amint a 4. ábrán látható, a DNáz I kezelést követő sűrűséggradiens centrifugálást követően a spermiumok (a) mozgásának aránya 3,416%-ról 35,083%-ra nőtt (10,27-szeres javulás), szemben a spermiumok 6,333%-ról 26,866%-ra (4,242-szeres javulás) a csak sűrűséggradiens kezelés esetén (p<0,0001, Kruskal-Wallis teszt többszörös összehasonlítás). Ami a (b) mozgást illeti, a DNáz I kezelést követő sűrűséggradiens centrifugálást követően a javulás szintén statisztikailag szignifikáns volt (a spermiumok 28,583%-áról 40,916%-ra (1,43-szoros növekedés), p=0,0112). A sűrűséggradiens centrifugálással kezelt csoportban a megfelelő javulás a spermiumok 34,533%-áról 46,466%-ra nőtt (1,34-szeres javulás), bár a csoportok közötti különbség statisztikailag nem volt szignifikáns (ns, Kruskal-Wallis teszt többszörös összehasonlítás). Továbbá a PR-mozgás az első csoportban a spermiumok 32%-áról 76%-ra nőtt (2,375-szörös), szemben a második csoport 1,776-szoros javulásával (a spermiumok 40,866%-áról 72,666%-ra) (nem statisztikailag szignifikáns a csoportok között, Kruskal-Wallis teszt többszörös összehasonlítás). A spermiumok (c) és (d) frakciójának motilitása 36,083%-ról 10,583%-ra, illetve 31,916%-ról 13,583%-ra csökkent. Az egyedül sűrűséggradiens centrifugálással kezelt csoportban a megfelelő csökkenés 29,40%-ról 14,80%-ra csökkent (statisztikailag nem szignifikáns a csoportok között, Kruskal-Wallis teszt többszörös összehasonlítással).
A DNáz I kezelést követő DGC és az egyedül végzett DGC összehasonlítása a hiperviszkózus sperma motilitásában. A kombinált kezelés nagyobb hatással volt a spermiumok mozgására, mint a DGC önmagában. w/o: sperma kezelés nélkül, kezelt: DNáz I-vel kezelt sperma, a: gyorsan progresszív spermiumok, b: lassan progresszív spermiumok, c: nem progresszív, d: immotilis, és és PR: motilitás (a+b).
A mosás utáni TPMSC-t az egyes preparátumok kezdeti számához (hozam) viszonyítva értékeltük (M&M). A sűrűséggradiens kezelés hozama a sperma viszkozitása nélküli egyed esetében 27,096% volt (5. ábra, w/o V-d). Ugyanezen készítmény hozama magas viszkozitású egyedek esetében (5. ábra, HV-d) 18,519% volt. A változás mindkét esetben a megfelelő kontrollhoz képest (azaz 5. ábra, w/o V, HV) statisztikailag szignifikáns volt (p<0,0001, illetve p=0,0377, Kruskal-Wallis teszt többszörös összehasonlítással), ami azt jelezte, hogy a DGC kezelés után sok PR spermium elveszett. Amikor a nagy viszkozitású egyedekből származó spermiumok DNáz-kezelésen estek át (5. ábra, HV-DNáz), a megfelelő hozam 42,47% volt, míg a sűrűséggradiens kezelés (HV-d) és a DNáz-kezelés (HV-DNáz) összehasonlítása p<0,0001-et eredményezett a HV csoporthoz képest, többszörös összehasonlítás Kruskal-Wallis teszt. A fenti eredmény nagyságrendje ellenére a DNáz kezelés kombinációja, amelyet sűrűséggradiens kezelés követ (5. ábra, HV-DNáz-d) 29,782%-os eredményt hozott (p=0,0121 a HV csoporthoz képest, Kruskal-Wallis teszt többszörös összehasonlítás). Ezenkívül a kombinált készítményt (HV-DNáz-d) összehasonlítottuk a PR spermiumok %-ával a nagy viszkozitású spermiumban minden kezelés előtt (5. ábra, HV), és p=0,448 eredményt kaptunk, ami azt jelenti, hogy a legtöbb PR spermiumot sikerült visszanyerni. Továbbá, a w/oV-d csoporttal összehasonlítva nincs statisztikailag szignifikáns különbség, mivel p=0,619 többszörös összehasonlító Kruskal-Wallis teszt.
A DGC, a DNáz-kezelés és a kettő kombinációja által elért %-os hozam (TPMSC kezelés után/ összes spermium a kezelés előtt) értékelése magas vagy normál viszkozitású spermában. w/oV-d: normál viszkozitású sperma DGC után, HV-d: magas viszkozitású sperma DGC után, HV-DNáz: magas viszkozitású sperma DNáz-kezelés után, és HV-DNáz-d: magas viszkozitású sperma DNáz-kezelés után, majd DGC. w/oV: normál viszkozitású sperma kezelés előtt; HV: magas viszkozitású sperma kezelés előtt.
A következőkben a spermiumok morfológiájának értékelése a DNáz I-vel történő tizenöt perces inkubációt követően a normális spermiumok arányának statisztikailag szignifikáns növekedését eredményezi 5,468%-ról 7,25%-ra, p=0,0197, amint azt a 6. ábra mutatja. Ugyanakkor a fej rendellenességei 81,75%-ról 74,937%-ra csökkentek (p=0,0004), míg a nyaki rendellenességek 22,062%-ról 19,343%-ra (p=0,0197). A farok abnormalitások és a citoplazmatikus cseppek ugyanezt a mintázatot követik. A morfológia ezen változásai következtében indokolt megfigyelni a teratozoospermia-indexre (TZI) gyakorolt jelentős hatást. Amint a 6. ábrán látható, az 1,205-ről 1,084-re csökkent (p<0,0001).
Tizenöt perces inkubáció DNáz I-vel racionalizálja a nagy viszkozitású sperma spermiumainak morfológiáját és TZI-jét. w/o: sperma kezelés nélkül, kezelt: DNáz I-vel kezelt sperma, head abn: fej abnormalitások, tail abn: farok abnormalitások, és TZI: teratozoospermia index.
4. Megbeszélés
Ebben a vizsgálatban azt feltételeztük, hogy a sperma hiperviszkozitása a NET-ekből ered. A bemutatott adatok azt mutatják, hogy a NET-ek extrudált DNS-ének emésztése megvalósítható, ami a spermiumok motilitásának javulásához vezet. Az ondóplazma DNS-ének enzimatikus emésztését a spermiumok motilitásának növelése céljából vizsgáltuk, ezáltal alkalmassá téve azokat az ART-ben való felhasználásra. A spermiumok cseppfolyósítását követő DNáz I alkalmazása a spermiumok mozgékonyságának és morfológiájának javulását eredményezte. Több inkubációs időpontot is alkalmaztunk a legjobb eredmények elérése érdekében, amelyeket 15 perces inkubáció után értünk el. A vizsgálat célja az intrauterin inszeminációs hozam javítása volt a szubfertilis férfiak kohorszában, akiknek a spermiumait nagy valószínűséggel az extrudált DNS által okozott akadályok miatt magas viszkozitás jellemzi. Továbbá a DNase I használata javította a rendellenes morfológiát, amely általában együtt jár a magas viszkozitással. A spermiumok dúsulását az izolált, gyors és lassan fejlődő spermiumok végső száma alapján is értékelték.
A spermiumok morfológiájának statisztikailag szignifikáns javulása a DNáz I kezelés után arra utalhat, hogy ezek a rendellenességek az ejakuláció után materializálódnak, és a magas viszkozitás miatt maradnak fenn. Tekintettel arra, hogy a hiperviszkózus sperma csökkent teljes antioxidáns kapacitással rendelkezik , a spermiumok jelenléte ebben a környezetben lipidperoxidációt és DNS-károsodást, végül pedig morfológiai károsodást idézhet elő. Legalábbis e morfológiai rendellenességek némelyike DNáz I kezeléssel reverzibilisnek bizonyult. Ez a javulás a fenti kezelés optimális alkalmazását sugallja olyan esetekben, amikor nem olyan nagyszámú, közvetlenül mozgékony spermiumra van szükség, mint a méhen belüli megtermékenyítés esetében, hanem amikor a lehető legjobb morfológiára van szükség, mint az IVF vagy a megtermékenyítésre szolgáló ICSI eljárás esetében .
Eredményeink azt mutatják, hogy a DNáz I alkalmazása csak hiperviszkozitás jelenlétében hatékony. Amint a 2. b) ábra mutatja, hiperviszkozitás hiányában a DNáz I alkalmazása nem. Pontosabban, normál viszkozitás mellett és a spermiumok motilitásától függetlenül az enzimes emésztés nem eredményezett statisztikailag szignifikáns különbséget a vizsgált paraméterek egyikében sem. Ezzel szemben a hiperviszkózus sperma kohorszában az enzim használata a PR-motilitás statisztikailag szignifikáns javulását eredményezte, amint az a 2. a) ábrán látható. Ezenkívül a HV csoportban nem volt különbség a spermiumok motilitásában és morfológiai helyreállításában a súlyos vagy mérsékelt viszkozitás szerint, bár a súlyos viszkozitású spermaminták száma alacsony volt. Ezen túlmenően, amint az 5. ábrán látható, a nagy viszkozitású csoport (HV-d) és a normál viszkozitású csoport (w/oV-d) között a DGC-előkészítést követően a statisztikailag szignifikáns különbség 0,0179, ami arra utal, hogy a javulás elérhető. Ezenkívül ugyanezen ábrán látható, hogy a kombinált kezelés (HV-DNáz-d) hozama a PR spermiumok százalékos arányának helyreállítását eredményezte, amely elérte a kezelés előtti magas viszkozitású (HV) férfiak megfelelő spermiumainak szintjét, mivel a PR végső százalékos aránya (29,782%, HV-DNáz-d) az első esetben nincs statisztikai különbség a kezdeti PR-hez képest (26,478%, HV a kezelés előtt), p=0,4480. E kombinált megközelítés jelentőségét, bár csökkenti a hozamot a csak DNáz-kezeléshez képest (p<0001 a HV-d és a HV-DNáz között), alátámasztotta az a tény, hogy a sűrűséggradiens kezelés kivonta a visszanyert, c) és d) osztályú spermiumok megfelelőit, ezáltal tisztította azokat. Ezzel szemben a DGC-készítmény (HV-d, 18,519%) és a “HV kezelés előtt” (26,478%) hozama közötti megfelelő statisztikai különbség szignifikáns volt (azaz p=0,0322).
Ezeken túlmenően helyettesítheti a hiperviszkózus sperma mechanikus kezelését; így általában hígítják vagy injekciós tűbe húzzák és átnyomják a megnövekedett viszkozitás leküzdése érdekében. Bár ezek a módszerek valószínűleg nem hatékonyak, mert ez a fajta kezelés növeli a ROS-termelést . Továbbá a hiperviszkozitás negatívan korrelál a kromatin integritásával, mint a hibás dekondenzációval, amit már megállapítottak .
A DNase I légúti alkalmazását az FDA már orvosilag is engedélyezte cisztás fibrózis esetén . Továbbá a DNáz az ondóplazma természetes összetevője, amelynek szerepe valószínűleg a női reproduktív pályán a gyulladásra reagáló neutrofil rekrutáció után képződő NET-ek hígítása, és a javasolt eljárás potenciálisan orvosilag alkalmazható az ART-ben. Szerepét az is növeli, hogy hiánya kedvezőtlen hatással van a főemlősök megtermékenyítésére .
A hiperviszkozitást valószínűleg vagy gyulladás, vagy az ondómirigyek bármilyen diszfunkciója okozza, bár a pontos mechanizmus nem világos. A genitális traktus vírusfertőzéseivel is összefüggésbe hozható, ahogyan azt laboratóriumunk korábban kimutatta . Számos terápiás protokollt alkalmaztak az ondó viszkozitásának csökkentése céljából, de ritkán voltak biztatóak az eredmények . Az olyan módszerek, mint a túlzott hidratálás és a prosztatamasszázs nem hozták a várt eredményeket. A proteolitikus enzimek , mint az alfa- kimotripszin használata reményteljes eredményeket adott , de alkalmazását nem fogadták el .
Egy másik vizsgálatban , DNase I-t használtak a viszkozitás csökkentésére , de a végeredmény ebben a tekintetben nem volt sikeres . A szerzők nem vizsgálták a minőségi spermiumparamétereket, azaz a motilitást. Ráadásul az inkubációs idő sokkal hosszabb volt (egy óra), mint az általunk javasolt (tizenöt perc), így a viszkozitásra gyakorolt semleges hatás valószínűleg az enzimnek a sperma plazmával való hosszabb inkubációjának tudható be.
Végezetül, azon adatok ellenére, hogy a sperma hiperviszkozitása összefüggésbe hozható a férfi genitális traktus gyulladásával, ill, ondóhólyagokkal, ami antibiotikumok és antioxidánsok alkalmazásához vezetett, ezek a terápiás formák csak azokban az esetekben tudták kezelni ezt az állapotot, amikor a fő tényező a gyulladás volt. Általában különböző tényezők okozzák, amelyek szinergikusan hatnak, és ezért nincs közvetlen ok-okozati terápia a hiperviszkozitásra .
A gyulladásos ingerek hatására a neutrofilek, az ondó fő leukocita populációja, a baktériumok fagocitózis általi inaktiválásán és az ezt követő, proteolitikus enzimeknek és ROS-nak való kitettség révén történő elpusztításon keresztül fejtik ki védő szerepüket. Egy másik hatásmód, amellyel a neutrofilek semlegesíthetik a kórokozókat, a neutrofil extracelluláris csapdák (NET-ek) termelésén keresztül történik. A NET-ek háromdimenziós, főként kromatinból álló rostos hálózatok, amelyek képesek csapdába ejteni és immobilizálni a mikroorganizmusokat. Kimutatták, hogy a NET-ek érzékenyek a DNáz, de nem a proteáz lebontására . Mivel a NET-ek kialakulása DNS-alapú, és a szeminális DNázról kimutatták, hogy megemészti az extrudált DNS-t és kiszabadítja az összegabalyodott spermiumokat, feltételeztük, hogy az exogén DNáz alkalmazása értékes kezelésnek bizonyulhat a főként az extracelluláris, exponált neutrofil DNS jelenléte által okozott szeminális hiperviszkozitás eseteiben.
A patofiziológiai szempontból szinte már kialakult az az elképzelés, amely a hiperviszkozitást a gyulladásnak tulajdonítja. A gyulladásos reakciók magukban foglalják a neutrofilekből a mikroorganizmusok befogására szolgáló NET-ek képződését. Nagyon valószínű, hogy a spermiumok sok energiát használnak fel arra, hogy megpróbálják kiszabadítani magukat a NET-ekből, és következésképpen oxidációs és apoptotikus állapotuk vizsgálata nagy jelentőséggel bír. Ráadásul a már leírt “csapdázó hatás” a spermiumok NET-ekbe való belegabalyodásuk miatti mozgásmegelőzésének következménye.
Ebben a tanulmányban megkíséreltük a NET-ek fő összetevőjének számító ondóplazma extracelluláris DNS-ének DNáz I-vel történő lízisét azzal a céllal, hogy kiszabadítsuk őket a NET-ekből és helyreállítsuk a spermiumok minőségi paramétereit, azaz a motilitást és a morfológiát. Ezenkívül, amint az 1. ábra mutatja, statisztikailag szignifikáns különbség van a WBC-koncentráció és a viszkozitási fokozat között. A javasolt kezelés a magömlés utáni fázisra korlátozódik, és nem a klinikai. Ezenkívül igazolták azt a kezdeti hipotézist, hogy a spermiumok megnövekedett viszkozitása a DNS jelenlétének eredménye az ondóban, bár további vizsgálatokra van szükség e hipotézis megerősítéséhez. Figyelembe véve, hogy a rekrutált neutrofilek NET-eket képeznek a gyulladt helyeken, feltételeztük, hogy a spermában lévő DNS neutrofilekből származik. Bár nem mutattunk be közvetlen bizonyítékot, amely alátámasztja ezt a feltételezést, úgy véljük, hogy ismereteink szerint a DNS fő lehetséges forrása a gyulladás során extrudálódó neutrofil kromatin.
5. Következtetések
Vizsgálati eredményeink alátámasztják azt a következtetést, hogy a DNáz I kezelés statisztikailag szignifikáns javulást eredményez a spermiumok motilitásában és morfológiájában. Csak hiperviszkózus sperma esetén javítja az ART-hez szükséges alapvető spermaparamétereket, azaz a motilitást és a morfológiát. Ezen túlmenően eredményeink arra utalnak, hogy az SHV egyik fő oka a NET-ek kialakulása, ezért javasoljuk e megközelítés terápiás potenciálját és hasznosságát.
Adatok elérhetősége
A tanulmány eredményeinek alátámasztására használt adatok kérésre elérhetők a megfelelő szerzőtől.
Etikai jóváhagyás
A jelen tanulmányban végzett és emberi résztvevőket érintő valamennyi eljárás összhangban volt az Athéni Nemzeti Kapodisztránus Egyetem Orvosi Karának Bioetikai és Deontológiai Bizottsága által 2014 januárjában jóváhagyott etikai előírásokkal (hivatkozási szám: 1130).
Egyetértés
Minden beteg tájékozott beleegyezését adta a vizsgálatban való részvételét megelőzően.
Érdekütközések
Minden szerző nem nyilatkozik konkurens pénzügyi érdekeltségről.
A szerzők hozzájárulása
Angelos D. Gritzapis és Vassilis Tsilivakos tervezte a vizsgálatot. Effrosyni Nosi, Angelos D. Gritzapis és Vassilis Tsilivakos végezték az adatgyűjtést, részt vettek a tervezésben és megszerkesztették a kéziratot. Effrosyni Nosi végezte az immunvizsgálatokat, Angelos D. Gritzapis pedig a statisztikai elemzést. Effrosyni Nosi, Angelos D. Gritzapis, Konstantinos Makarounis, Georgios Georgoulias, Vasilios Kapetanios, Christodoulos Papanikopoulos, Anastasia Konstantinidou, Panagiotis Venieratos, Marighoula Varla-Leftherioti és Vassilis Tsilivakos részt vettek az adatok elemzésében és értelmezésében. Minden szerző elolvasta és jóváhagyta a kézirat végleges változatát.
Köszönet
A projektet a Locus Medicus S.A.
Klinikai Diagnosztikai Laboratórium finanszírozta.