A fehérjéknek kölcsönhatásba kell lépniük más fehérjékkel, hogy funkcionális komplexeket alkossanak. Sok esetben a fehérjék sejteken belüli működését nem lehet megérteni a fehérje szerkezetére vonatkozó információk és annak ismerete nélkül, hogy a fehérje milyen komplexben helyezkedik el.1, 2 Ez például a DNS-en lévő epigenetikai információt módosító fehérjék esetében kiemelkedő fontosságú. Szinte valamennyi ilyen kromatint módosító fehérje intenzív kölcsönhatást igényel metabolikus enzimekkel, amelyek biztosítják a hiszton acetilációhoz, deacetilációhoz vagy metilációhoz és demetilációhoz szükséges kofaktorokat.3-5 Ez jól mutatja, hogy egy adott fehérje működésének és aktivitási állapotának elemzéséhez szükség van egy adott fehérje komplex környezetének vizsgálatára. A fehérjék keresztkötése tömegspektrometriás elemzéssel (XL-MS) kombinálva ideális módszer arra, hogy információt nyerjünk a fehérjék szerkezetéről és a fehérjekomplexek összetételéről.6-9 Az XL-MS-hez speciális kémiai reagensekre, keresztkötőkre van szükség, amelyek képesek kovalensen összekapcsolni a közeli, például komplexben kölcsönhatásban lévő fehérjemaradékokat.10, 11 A keresztkötött peptidek tömegspektrometriás jellemzése azonban két okból is komoly kihívást jelent. Először is, a keresztkötések azonosítását nem csak egy, hanem két összekapcsolt peptid fragmentumionjainak elemzésével kell elvégezni, ami jelentősen bonyolítja az MS2 spektrumokat. Másodszor, a keresztkötéses peptidfajok csak nagyon kis gyakorisággal fordulnak elő, és egy olyan peptidkeverék részét képezik, amelyben túlnyomórészt a nem keresztkötéses peptidek dominálnak. Ez sok esetben drámai információveszteséghez vezet, ami megnehezíti a keresztkötések pontos azonosítását, és ezáltal az interaktom-elemzést. Néhány keresztkötési reagens kifejlesztésére került sor, amelyek az MS-ben hasítható csoportokat és az XL dúsítás lehetőségét vezették be e problémák kezelésére.12-18

Ezekben egy új keresztkötési reagens kifejlesztéséről számolunk be, amely dúsítható és olyan hasítási tulajdonságokkal rendelkezik, amelyek lehetővé teszik a pontos keresztkötések azonosítását. A tervezett cliXlink (1) az 1. ábrán látható. A sejtáteresztő reagens (1. ábra A és az S1 ábra az alátámasztó információkban) két szukcinimidil-észter egységgel rendelkezik, amelyek képesek reagálni a fehérjékben lévő nukleofilokkal, és nagyjából 9 Å távolságra vannak egymástól; így lehetővé teszi a rövid távolságok rögzítését a fehérjék szerkezeti információinak megszerzéséhez és az egymáshoz közel lévő fehérjék rögzítéséhez. A hatékony MS hasíthatóságot a jól bevált szulfoxidcsoport biztosítja, amely a peptid fragmentálódása előtt alacsony energiájú ütközés-indukált disszociációs (CID) körülmények között hasítható. Emellett egy alkin egység lehetővé teszi, hogy CuAAC reakció segítségével dúsító rész, például biotin, kapcsolódjon a keresztkötési helyekre.19

A keresztkötő alkalmazása követheti az 1. B ábrán ábrázolt munkafolyamatot. Ennek során az 1. reagens hozzáadása egy komplex proteomhoz, rögzíti a közeli peptidek natív állapotú távolságinformációit, és megőrzi azokat a további munkafolyamat során az MS analízishez. A dúsításhoz szükséges affinitási csoport rögzítése a keresztkötés után történik a terjedelmes dúsító csoportok zavaró hatásának elkerülése érdekében. A térhálósított peptidek fehérjeszinten történő módosításával a felesleges kismolekulás reagensek könnyen eltávolíthatók acetonos kicsapással. Ezt követi a fehérjék enzimatikus emésztése. A térhálósított peptideket ily módon például biotinnal jelöljük, ami lehetővé teszi a dúsításukat. Ezt követően tömegspektrometriával elemzik őket. Mivel a keresztkötésben lévő egyes peptidek tömegei nem azonnal hozzáférhetők, a keresztkötések hozzárendelése nehéz, különösen összetett minták esetén. Ez megköveteli az MS-hasadó reagensek használatát, amelyek specifikus fragmentionok képződésével megkönnyítik az MS2 azonosítást.20, 21 A legjobb esetben a reagensnek lehetővé kell tennie az MS3 kísérleteket is, amihez a keresztkötőanyagot a peptidek előtt kell hasítani. Ez lehetővé teszi a peptidek szétválasztását az egyedi MS3-alapú azonosításhoz. Az 1. reagensünk a szulfoxid mindkét oldalán β-hidrogénatomokat tartalmaz, így a fragmentáció két irányban történik, ahogy az 1. C ábrán látható. Ez a peptidek (α, β) tiszta elválasztásához vezet, és minden peptidhez két fragmentumot generál: egy alkén és egy szulfénsav fragmentumot; az utóbbi vízvesztéskor tiált alkot. Ez két jellegzetes Δm/z≈32 tömegpárt eredményez. Fontos, hogy megfigyeltük, hogy az a fragmentációs útvonal (1. ábra C) dominál. Az α-peptid esetében tehát az alkén fragmentum, a β-peptid esetében pedig a tiál fragmentum a fő hasadási termékek. Az aszimmetrikus hasadási tulajdonságok miatt a jelintenzitás nagy része peptidenként egy fragmentumon marad meg, ami kiváló érzékenységet biztosít az MS3-kísérletek során.

A reagens 1 szintézise egyszerű (1. séma). A kiindulási pont a homocisztein 2 oxidált diszulfid dimere, amelyet 4-pentinsavval kezelve a 3 diszulfidot kapjuk. A diszulfid reduktív hasítása és a keletkező tiolok metil-3-brom-propionáttal történő alkilezése a 4 szulfidvegyületet eredményezi. Mindkét metil-észter szappanosítása 5-re és az 5 átalakítása aktivált biszuccinimidil-észterré 6, majd a tioéter oxidációja szulfoxiddá, összesen 16 %-os hozammal adja az 1 reagenset. Különösen fontos, hogy a reagens nagyon tiszta, és a reaktív észteregységek mindkét oldalon a helyükön vannak. A részleges hidrolízist el kell kerülni. Ezt egy végső kicsapásos tisztítással biztosítottuk. Az 1. reagens etil-acetát és diklórmetán keverékében oldottuk, és hexánok hozzáadásával kicsaptuk.

A következőkben az 1 MS tulajdonságait vizsgáltuk. Ehhez az 1-t az általánosan használt modellfehérjéhez, a szarvasmarha szérumalbuminhoz (BSA) adtuk. Az 1. B ábrán ábrázolt munkafolyamatot követtük a dúsítási lépés elvégzése nélkül. Röviden, az 1 fehérjeoldathoz történő hozzáadása és 1 órán át szobahőmérsékleten és fiziológiás pH-n történő reakciója után a fehérjét acetonnal kicsaptuk, pufferben reszuszpendáltuk (lásd az alátámasztó információkat), majd ezt követően a fehérjét tripszin és Lys-C keverékével emésztettük.

A kapott peptidkeveréket C18 Tip oszlopokkal sótalanítottuk és HPLC-MS2 segítségével elemeztük (2. ábra). A 2. A ábra két keresztkötésű BSA peptidet (α+β) mutat példaként. Az ép keresztkötés pontos tömegének meghatározása után (m/z 677,1; 2. B ábra) CID és HCD fragmentációt is végeztünk a prekurzoron a fragmentációs tulajdonságok kiértékelése érdekében (2. C ábra). A szelektívebb CID-fragmentáció (a keresztkötés ionjának rezonancia gerjesztése; 2. ábra C, felső spektrum) alacsony, 25 %-os normalizált ütközési energiával a várakozásoknak megfelelően csak kis számú intenzív jelet szolgáltat. Két kiemelkedő jelpárt kapunk, amelyek Δm/z értéke 32 (Δmrep), a keresztkötő ion fragmentációjának köszönhetően, amely minden peptid esetében egy tiál (α-/β-thial) és egy alkén (α-/β-alkén) fragmentumot eredményez. Mint már említettük, az a fragmentációs útvonal (1. ábra C) előnyben részesül, ami aszimmetrikus intenzitáseloszláshoz vezet. A várt intakt, elválasztott peptidek domináns képződése következésképpen a reagens alkalmassá teszi a kifinomultabb MS3-kísérletek elvégzésére.

A vizsgálatunkhoz HCD fragmentációt használtunk. Ez a módszer egyidejűleg biztosítja a keresztkötő hasítását és az azonosításhoz szükséges peptidfragmentumok képződését (2. ábra C, alsó spektrum). A keresztkötés/peptid felismerés segítése érdekében fontos, hogy a HCD fragmentáció továbbra is biztosítja az alkén és a tiál fragmentumokat. A HCD-adatok tehát lehetővé teszik a peptidek MS2 segítségével történő azonosítását.

Ezt a módszert alkalmazva az adatokat a szabadon elérhető MeroX szoftverrel elemeztük, szigorúan szűrve minden keresztkötés-azonosítást (score >50, hamis felfedezési arány (FDR) 1 %), és megkövetelve a két jellegzetes tömegpárból legalább három ion jelenlétét a négyből.23, 24 A CuAAC-alapú dúsítás lehetőségének kihasználása nélkül 61 egyedi BSA-keresztkötést tudtunk azonosítani egyetlen mérés során (2. ábra D).25 Ez az eredmény reprezentatív a laboratóriumunkban tisztított BSA-val végzett mérésekre. Emellett ábrázoltuk a BSA kristályszerkezetében talált keresztkötéseket, és megállapítottuk, hogy a mért távolságok többsége ésszerű volt. Fontos, hogy a keresztkötések 22,1 Å átlagos Cα-Cα távolságot mutatnak a keresztkötött aminosavak között, és a távolságok eloszlása tökéletesen megegyezik azzal, ami egy olyan reagenssel történő keresztkötés esetén várható, amely az aktív észtereket körülbelül 9 Å távolságban tartja (2. E és S2 ábra)26 , figyelembe véve az oldalláncok hosszát és a fehérje molekuláris dinamikáját.27 A keresztkötés leginkább két Lys-maradék között történt (49 %), de észleltünk Lys-Thr (30 %), Lys-Ser (13 %) és Lys-Tyr (8 %) kapcsolatokat is, ami összhangban van a szukcinimidil-észterek reaktivitásával (2. ábra F).28

Ez a siker lehetővé tette számunkra, hogy az új keresztkötőanyagot komplexebb környezetben is validáljuk. Különösen a CuAAC-alapú dúsítási lehetőség többletértékét kívántuk bemutatni. Ehhez a kísérlethez ismét keresztkötést végeztünk a BSA fehérjével (10 μg), kicsaptuk azt acetonnal, újra feloldottuk a keresztkötésű fehérjét, majd ezt követően a 7 (3. ábra A) és CuSO4/tris(3-hidroxipropiltriazolilmetil)amin (THPTA) hozzáadásával elvégeztük a click-reakciót (S3 A ábra), majd nátrium-aszkorbát hozzáadásával a CuII CuI-vá redukálódott. Szobahőmérsékleten 1 óra elteltével újabb acetonos kicsapást végeztünk a felesleges biotin-azid eltávolítása érdekében. Ezután tripszint és Lys-C-t adtunk az emésztéshez.

A peptideket ezután HEK-sejtkivonatból nyert fehérjeemésztéssel (435 μg fehérje; 3. ábra B) kombináltuk. Ezáltal a nem keresztkötődött peptidek masszív hátterét hoztuk létre. Ha most elemeztük a keresztkötéseket ezen a nagy háttéren belül (3. ábra C), akkor csak nagyon kevés keresztkötés spektrális egyezést (átlagos CSM=5,0), egyedi keresztkötéses helyet (átlagos egyedi XLs=3,7), valamint monolinkt (átlagos=5,3) azonosítottunk, amelyekben egy szukcinimidil-észter hidrolizálódott a fehérjével való reakció előtt. Ha azonban a dúsítást sztreptavidin bevonatú mágneses gyöngyökkel végeztük, a keresztkötések azonosításának száma drámaian javult. A peptidkeverék mágneses részecskékkel történő inkubálását; a gyöngyök pufferrel történő kiterjedt (6×) mosását (lásd a Támogató információkban) és a diszulfid enyhe, reduktív hasítását követően a “befogott” keresztkötések felszabadítása és ezáltal a biotin-rész eltávolítása érdekében (S3 B ábra), most már átlagosan 95,0 CSM-et és 37,0 egyedi XL-t detektáltunk 184,3 monolinkkel együtt. Az azonosított egyedi XL-ek száma alacsonyabb volt, mint a tisztított BSA esetében (2. ábra D), ami a CuAAC-reakció hatástalanságával vagy a nem keresztkötéses komplex háttér interferenciájával magyarázható. Ez az eredmény azonban azt mutatja, hogy az új térhálósítószerünk, az 1, képes a térhálósított peptideket a nem módosított peptidek nagy feleslegében feldúsítani; így megkönnyíti a kevés térhálós kötést tartalmazó komplex minták elemzését. Eredetileg szkeptikusak voltunk az 1 aszimmetrikus szerkezetével kapcsolatban. Az adatok azonban azt mutatják, hogy ennek ellenére nagyszámú keresztkötést sikerült azonosítani.

Összefoglalva, az új 1 keresztkötőszerünk a következő előnyöket egyesíti: először is, a reagens mérete ideálisan alkalmas arra, hogy értékes távolsági információkat nyerjünk a strukturális proteomika számára. Ezenkívül a molekula sejtáteresztő, és az alkin egység nem okoz jelentős interferenciát a térhálósítási reakcióban. Továbbá a robusztus, hatékony szulfoxid-fragmentáció leegyszerűsíti a keresztkötések azonosítását. Az 1-gyel keresztkötött peptidek click-kémiával történő funkcionalizálásának lehetősége lehetővé teszi különféle módosítások és dúsítási stratégiák alkalmazását, amelyek lehetővé teszik a kis mennyiségben előforduló keresztkötések elemzését. Összefoglalva, az 1-es reagensünk mostantól megnyitja az utat az MS2- és MS3-kísérletek segítségével végzett komplex interaktom-elemzéshez.

Összeférhetetlenség

A szerzők nem nyilatkoznak összeférhetetlenségről.