Anyagok és módszerek

Mintagyűjtés

A 18 éves és idősebb résztvevőket e-mail értesítések és a Vancouverben található University of British Columbia hirdetőtábláin elhelyezett hirdetések útján kérték fel a vizsgálathoz való csatlakozásra. A résztvevőket arra kérték, hogy önvezető utasítások alapján adjanak mintát szárazon rögzített bukkális tamponnal (Puritan PurFlock, Fisher Scientific, Waltham MA) és szivacsos bukkális tamponnal (Oragene ORAcollect, DNA Genotek, Ottawa, ON); a minták leadásának sorrendjét számítógépes randomizálással határozták meg. A mintavétel során egy kutatási asszisztens volt jelen, aki válaszolt a résztvevőknek a mintavételre vonatkozó utasításokkal kapcsolatos kérdéseire. Minden mintát szobahőmérsékleten tároltak. Farmakogenetikai jelentéseket nem adtak a résztvevőknek, mivel ez nem tartozott e vizsgálat tárgykörébe.

DNS extrakció

A DNS extrakció az Ambion MagMAX gyöngy alapú DNS extrakciós készlet (Applied Biosystems, Foster City, CA) segítségével történt a gyártó utasításainak megfelelően. A DNS extrakciót a mintagyűjtés után 3 nappal végeztük, és 60 µl-ben eluáltuk ki. A DNS mennyiségét és minőségét Qubit 2.0 fluoreszcencia assay (ThermoFisher Scientific, Waltham MA) segítségével értékeltük. A minták tisztaságát az A260/280 optikai sűrűség (ODA260/280) értékek alapján határoztuk meg NanoVue spektrofotométer segítségével.

Genotipizálás

A genotipizálást a QuantStudio 12K Flex mennyiségi polimeráz láncreakció (qPCR) műszerrel (LifeTechnologies, Carlsbad, CA) végeztük a gyártó által validált próbák alapján (ThermoFisher Scientific, Waltham MA). A próbák tartalma 28, a gyógyszerre adott választ befolyásoló SNP-t tartalmazott az OpenArray platformon (lásd a 2. kiegészítő fájlt) és egy CYP2D6 CNV TaqMan próbát (Assay ID: Hs_00010001_cn). Az assay-k validálása érdekében 44 DNS-kontrollt genotipizáltak a National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), Human Genetic Cell Repository at the Coriell Institute for Medical Researchből. A hívások egyezőségét megerősítették a várt genotípussal. Ezenkívül a kontroll DNS Sanger-szekvenálásával igazolták az eredményeket. Minden egyes futtatáshoz a résztvevők mintáit duplikátumokban futtatták az OpenArray-n és négyszeres példányban a CNV assay-n, valamint a pozitív kontrollként és sablon nélküli kontrollként (NTC-k) használt Corriell DNS-mintákat.

Statisztikai elemzés

A TaqMan Genotyper v1.3.1 szoftver (Applied Biosystems) az OpenArray-n végzett SNP-genotipizálási hívási arányok meghatározására szolgált. A genotípus-hívási arányt minden egyes OpenArray próbára úgy számították ki, hogy a sikeresen hozzárendelt genotípusok teljes számát elosztották a genotípus hozzárendelési kísérletek teljes számával.

A CNV TaqMan próbához a CopyCaller v2.1 szoftvert (Applied Biosystems, Foster City, CA) használták a CYP2D6 kópiaszám-hívások és a CNV bizalmi pontszámok hozzárendeléséhez. A DNS-mintákhoz vad típusú diploid kópiaszámot rendeltünk, a kópiaszám-variációkat (deléciós vagy duplikációs események) pedig a 2N, illetve a CNV csoportokba soroltuk. Az SNP- és CNV-genotipizálási eredményekhez 95%-os genotipizálási arányt és 95%-os megbízhatósági pontszámot határoztak meg. Kétmintás Student’s t-tesztet számoltunk egyenlőtlen varianciákat feltételezve, hogy meghatározzuk a különböző DNS-típusokból származó DNS-hozam, tisztaság és hívási arányok közötti szignifikáns különbséget a párokban. Az egyazon résztvevőtől származó DNS-mintatípusból (szivacsos vs. szárazon rögzített) generált genotipizálási hozzárendeléseket összehasonlítottuk a konkordancia kiszámításához.

Eredmények

Harmincegy résztvevőt toboroztunk és gyűjtöttünk szivacsos tamponokat és szárazon rögzített tamponokat. A résztvevők mindkét tampontípus esetében egyszerűnek és könnyen követhetőnek találták a gyűjtésre vonatkozó önvezető utasításokat. A résztvevők kérdéseket tettek fel a tamponok bedörzsöléséhez szükséges nyomással és a tamponok szájban való helyes elhelyezésével kapcsolatban. A résztvevők megjegyzései a két tamponnal kapcsolatban hasonlóak voltak, egyesek a szivacsos tamponokat, mások a száraz tamponokat részesítették előnyben; a vélemények között nem alakult ki konszenzus.

A száraz tamponnal és a szivacsos tamponnal gyűjtött DNS átlaga között jelentős különbség volt (0,26 ± 0,34 µg vs. 1,91 ± 1,44 µg p = 4,4 × 10-7; 1. táblázat). Az átlagos DNS-tisztaság minden gyűjtési típusban a tiszta DNS esetében az elfogadott tartományban volt (átlag (SD)) 1,72(0,78) és 1,85(0,39) a száraz tamponok és a szivacsos tamponok esetében.

A szivacsos tamponokból gyűjtött minták között három olyan volt, amelynek DNS-koncentrációja alacsony volt (< 5 ng/µl). Ez a három minta 100%-os genotipizálási hívási arányt mutatott az OpenArray-n és 100%-os CNV megbízhatósági pontszámot (1. ábra). Ezzel szemben az egyik minta, amelynek DNS-koncentrációja 79 ng/µl volt, a legalacsonyabb OpenArray hívási aránnyal rendelkezett (18%). A legmagasabb hívási arányt az OpenArray-n (> 95%) a száraz blokkolt tamponok esetében hét olyan minta esetében figyelték meg, amelyek koncentrációja 1,2 és 8,9 ng/µl között mozgott (1a. ábra). A legmagasabb CNV-megbízhatósági hívások (> 95%) az 1,0 és 24,4 ng/µl közötti koncentrációjú minták esetében voltak megfigyelhetők (1b. ábra).

Az OpenArray összes vizsgálatára vonatkozóan, A szivacsos tamponokból gyűjtött DNS-minták összességében magasabb genotipizálási hívási arányt (97%) eredményeztek, mint a száraz tamponokból gyűjtött minták (54%) (ábra. 2). Az extrahált DNS 0,5-szeres hígításával kiegészített lépésben a szivacsos tamponok esetében a genotipizálási hívási arány > 95% volt. Az OpenArray-n a minták hívási aránya egyénenként változott: 29 (93,5%) résztvevőnél a szivacsos tampon DNS-éből származó minták hívási aránya > 95% volt, míg 4 (12,9%) résztvevőnél a száraz tampon DNS-éből származó minták hívási aránya > 95% volt. A sikeresen genotipizált próbák 94%-os egyezőségét figyelték meg az ugyanattól az egyéntől gyűjtött szivacsos tamponok és száraz tamponok között.

A szivacsos tamponokból származó minták 2(6,5%) mintájához rendelték hozzá a CYP2D6-ra vonatkozó másolatszám-hívásokat, 0,99-es általános megbízhatósági pontszámmal. Ehhez képest a száraz tamponból származó minták 8(25,8%-a kapott kópiaszámhívást, 0,91-es általános megbízhatósági pontszámmal (lásd a 3. kiegészítő fájlt).

Diszkusszió

A kutatás célja, hogy segítse a kutatókat és a vállalatokat egy olyan optimális gyűjtési módszer meghatározásában, amely kiváló minőségű DNS-t eredményez a genotipizáláshoz. Ez a vizsgálat új információkkal szolgál a kétféle tamponminőségről, amely magas volt (az ODA260/A280 1,8-ban meghatározott), bár szignifikáns különbség volt a DNS-hozamban (p-érték = 4,4-7). Az OpenArray platformon a szivacsos tamponoknál volt a legmagasabb az általános genotipizálási hívási arány (97% vs. 54%) és a CYP2D6 CNV TaqMan Assay esetében a legmagasabb a megbízhatósági pontszám (0,99 vs. 0,91). A > 95%-os SNP genotipizálási hívási arány elfogadható minőségű adatot tükröz, a 99%-os CNV megbízhatósági pontszám pedig kiváló minőségűnek minősül .

A szivacsos tamponból izolált DNS-minták közül egynek a hívási aránya 95% alatti volt. A rutin laboratóriumi gyakorlatban az alacsony hívási arányú mintákat a hiányos eredmények miatt visszavennék a betegjelentésekhez. Ennek a mintának a kihagyása 99,5%-ra növelte a szivacsos tamponok teljes genotípus-meghatározási arányát.

A CYP2D6 CNV eredmények a szivacsos tamponokból gyűjtött DNS esetében a szivacsos tamponokhoz képest 8 (25,8%) CNV-hozzárendelés növekedését mutatták 2 (6,5%). A magasabb számú CNV-hozzárendelések alacsonyabb megbízhatósági pontszámmal korreláltak. A résztvevők többsége, 30(97%) olyan mintát tudott gyűjteni, amely a szivacsos tampon esetében magas genotípus-meghatározási arányt eredményezett, míg csak néhány személy, 4(13%) tudott mindkét tampontípus esetében magas meghatározási arányú mintát gyűjteni. Következésképpen a szivacsos tamponok elfogadhatóak voltak a betegek számára, és jó minőségű, megfelelő hozamú DNS-t szolgáltattak a qPCR-alapú farmakogenetikai vizsgálatokhoz.