Gen-Targeting in embryonalen Stammzellen

Durch den Prozess des Gen-Targeting in ES-Zellen kann potenziell jede gewünschte genetische Manipulation in die Keimbahn von Mäusen eingeführt werden. Spezifische Gensequenzen können entweder konstitutiv oder bedingt gelöscht werden (Knock-out), spezifische Mutationen oder Basenpaarveränderungen können präzise innerhalb eines Gens von Interesse vorgenommen werden und Reportergene oder andere Expressionskassetten können an definierten Stellen im Genom eingeführt werden (Knock-in). Mäusesequenzen können mit dieser Technologie gegen menschliche Sequenzen ausgetauscht werden, um humanisierte Mausmodelle zu erzeugen.

Diese Technik kann bis zu einem Jahr Entwicklungszeit in Anspruch nehmen, so dass es wichtig ist, zu Beginn des Projekts viel Zeit zu investieren, um sicherzustellen, dass die am besten geeignete Technologie und genetische Strategie für das gewünschte Modell ausgewählt wird. Der transgene Kern kann bei dieser Art von Entscheidungen beratend zur Seite stehen, und es ist wichtig, dass alle Targeting-Projekte vor Beginn der Arbeit im Labor ausführlich mit dem Kern besprochen werden.

Wenn eine Strategie beschlossen wurde, wird ein Targeting-Vektor konstruiert und eine robuste Screening-Strategie entwickelt und getestet, um sicherzustellen, dass die gewünschte genomische Manipulation auf genomischer Ebene nachgewiesen werden kann. Der Targeting-Vektor wird dann in ES-Zellen transfiziert, und die rekombinanten Klone werden auf das gewünschte homologe Rekombinationsereignis untersucht. Diese Zellen werden dann in Präimplantationsembryonen injiziert und die daraus resultierenden chimären Mäuse werden für die Züchtung der genetisch veränderten Mauslinie verwendet.

Service

Es wird ein flexibler Service angeboten, der je nach den verfügbaren Ressourcen in die einzelnen Phasen der Modellentwicklung unterteilt werden kann.

Projektinitiierung – kostenlos

• Beratung mit der Gruppe, um eine geeignete Technologie für ein sicheres, brauchbares Modell zu finden
• Screening von Genfallen-Datenbanken nach bereits vorhandenen ES-Zellklonen
• Screening von Ressourcen des Knock-out-Konsortiums nach bereits vorhandenen Targeting-Vektoren, ES-Zellklone und Modelle

Beratung bei der Konstruktion von Targeting-Vektoren – kostenlos

• Genomische Sequenzanalyse zur Identifizierung von Regionen, die mit hoher Wahrscheinlichkeit brauchbare Homologieregionen für das Gen-Targeting sind
• Beratung mit der Gruppe bei der genetischen Strategie, die für ein sicheres,
• Die Konstruktion des Targeting-Vektors wird nicht vom Kern bereitgestellt, aber der Kern kann bei der Bereitstellung von Kassetten und methodischer Beratung helfen
• Die Entwicklung der Screening-Strategie wird nicht vom Kern bereitgestellt, aber der Kern kann bei der Bereitstellung von Kassetten und methodischer Beratung helfen Beratung

Gen-Targeting in embryonalen Stammzellen

• Transfektion des fertigen Targeting-Vektors in embryonale Stammzellen
• Isolierung und Lagerung von mindestens 192 unabhängigen rekombinanten Zellklonen
• DNA-Vorbereitung und Lieferung von 96-Well-Platten für das Screening
• Auftauen, Expansion mutmaßlich positiver Klone
• Zusätzliche DNA-Präparation aus mutmaßlich positiven Klonen für das Bestätigungsscreening
• Karyotyp-Analyse der Zielklone

Blastozysten-Injektion von ES-Zellklonen

• ES-Zell-Injektion in Präimplantationsembryonen
• Generierung und Unterbringung von Chimären für bis zu 3 Wochen.
• Empfehlungen für die Zuchtstrategie