Utilité de l’acide organique produit par Exiguobacterium sp. 12/1 sur la neutralisation des eaux usées alcalines
Abstract
Le but de cette étude était d’examiner le rôle des acides organiques produits par Exiguobacterium sp. souche 12/1 (DSM 21148) dans la neutralisation des eaux usées alcalines émanant de l’industrie des boissons. Cette bactérie est connue pour sa capacité à se développer dans un milieu au pH aussi élevé que 12,0 et à neutraliser les eaux usées industrielles alcalines de pH 12,0 à pH 7,5. La recherche initiale sur le type de groupes fonctionnels présents dans le milieu, effectuée à l’aide de la spectroscopie FT-IR, a révélé la présence de pics correspondant au groupe carbonyle et au groupe hydroxyle, ce qui suggère la libération d’acide carboxylique ou de produits métaboliques apparentés. L’identification du groupe carboxylique spécifique, effectuée par RP-HPLC, a révélé la présence d’un pic unique dans le surnageant de culture avec un temps de rétention très similaire à celui de l’acide formique. La concentration de l’acide produit sur différentes sources de carbone a été étudiée en fonction du temps. Bien que l’acide soit présent à la même concentration finale, le taux de production d’acide était le plus élevé dans le cas d’un milieu supplémenté en saccharose, suivi du fructose et du glucose. La connaissance des produits métaboliques de la bactérie peut être considérée comme une première étape vers la réalisation de son potentiel pour la biorémédiation à grande échelle des eaux usées alcalines de l’industrie des boissons.
1. Introduction
Les alcaliphiles – des micro-organismes qui ont des pH optimaux pour la croissance à ou au-dessus de pH 9 – ont eu un grand impact dans les applications industrielles. Les détergents biologiques contiennent des enzymes, telles que des cellulases alcalines et/ou des protéases alcalines, qui ont été produites à partir d’alcaliphiles . Les alcaliphiles ont également été utilisés pour la production industrielle d’enzymes pouvant avoir un usage spécifique, par exemple, la cyclodextrine par la glucanotransférase cyclomaltodextrine alcaline et l’α-amylase active alcaline formant du maltohexaose, qui trouvent une application dans les industries alimentaire, chimique et pharmaceutique. Il a été signalé que la pâte de bois traitée par des alcalis pouvait être blanchie biologiquement par des xylanases produites par des alcaliphiles. Fujiwara et ses collègues ont signalé l’utilisation d’une protéase alcaline pour décomposer le revêtement gélatineux de films radiographiques, à partir duquel l’argent a été récupéré. Les alcaliphiles ont également prouvé leur potentiel dans la biodégradation d’une variété de composés organiques .
Donc, les bactéries alcaliphiles ont suscité beaucoup d’intérêt en raison de leurs enzymes extracellulaires et de leurs propriétés biochimiques telles que l’alcaliphilie et la stabilité aux alcalis. Leur bioénergétique a également été étudiée de manière assez détaillée, alors que peu de choses sont connues sur leur physiologie, par exemple, les enzymes et les métabolites intracellulaires. Les caractéristiques du processus métabolique intermédiaire sont importantes car elles aident à caractériser la bactérie, sa composition enzymatique, le stade métabolique des cellules et les possibilités d’ingénierie métabolique. La capacité des alcaliphiles à faire varier fortement le pH d’un milieu contenant des hydrates de carbone a été exploitée dans des travaux antérieurs pour neutraliser des eaux usées très alcalines provenant de l’industrie des boissons en utilisant la souche 12/1 d’Exiguobacterium sp. Le genre Exiguobacterium appartient à l’ordre des Bacillales qui comprend également des membres du genre Bacillus. Exiguobacterium sp. 12/1 est un alcaliphile facultatif qui se développe de manière optimale à un pH de 10 et est capable de neutraliser les eaux usées alcalines pour les ramener d’un pH de 12,0 à un pH de 7,5. On suppose que la bactérie libère un ou plusieurs produits métaboliques acides afin de neutraliser le milieu extérieur fortement alcalin. Cependant, il est important de caractériser le type de métabolites libérés dans le milieu extracellulaire. Ici, nous étudions la production d’acides organiques comme mécanisme possible de neutralisation des alcalins. Ces types d’études seront nécessaires avant que les applications à grande échelle de la bactérie pour la neutralisation des eaux usées alcalines de l’industrie des boissons puissent être développées.
La principale source de carbone dans les eaux usées de l’industrie des boissons gazeuses est le saccharose (disaccharide contenant du glucose et du fructose) qui est également le principal contributeur à sa demande biochimique en oxygène (DBO) . La DBO moyenne des eaux usées de l’industrie des boissons gazeuses varie entre 600 et 4500 mg/L, ce qui équivaut à 673-5052 ppm de saccharose. Une étude bibliographique des produits métaboliques d’un grand nombre de bactéries se développant sur des sucres simples suggère que les bactéries pourraient utiliser ces sucres simples pour générer des acides organiques. Ceci est corroboré par l’analyse des produits métaboliques extracellulaires d’autres espèces de Bacillus alcaliphiles. Dans ces études, le principal acide organique produit à partir de la source de carbone qu’est le saccharose est l’acide acétique. L’acide formique est un métabolite commun des bactéries neutrophiles dans des conditions anaérobies, tandis que B. circulans var. alkalophilus en produit jusqu’à 2 g/L même dans des cultures aérobies. D’autres acides volatils comme les acides propionique, butyrique, isobutyrique et isovalérique sont typiques des souches Bacillus alcalophilus ssp. halodurans, B. alcalophilus et Bacillus sp. 17-1. Les acides isobutyrique et isovalérique ont été signalés dans le milieu de plusieurs bacilles neutrophiles. Mais ces acides, ainsi que les acides propionique et butyrique, sont considérés comme provenant d’acides aminés d’après des études sur Clostridium sp. Les acides lactique et pyruvique sont assez fréquemment produits par les bacilles neutrophiles, mais la production d’acide succinique par Bacillus est rare. L’éthanol n’a pas été détecté dans les bacilles alcalins alors qu’il est un produit typique des cultures de glucose de nombreux bacilles neutrophiles. Les conditions de croissance alcalines peuvent donc affecter la production des métabolites neutres. Dans cette étude, nous avons utilisé la chromatographie liquide haute performance en phase inverse pour étudier le type et la concentration des acides produits par la souche 12/1 d’Exiguobacterium sp. pendant la neutralisation d’un milieu à pH élevé contenant différents types de sources de carbone.
2. Matériaux et méthodes
2.1. Souche et conditions de culture
La culture Exiguobacterium sp. 12/1 a été obtenue auprès de DSMZ (DSM 21148) et a été maintenue sous forme de stocks de glycérol. Un milieu basal alcalin (ABM) contenant (toutes les concentrations en g/L) : peptone, 1 ; extrait de levure, 0,5 ; glucose, 1 ; K2HPO4, 0,1 ; Na2CO3, 1 ; pH 10 (les trois derniers composants ajoutés au milieu autoclavé à partir de solutions stérilisées séparément) a été utilisé pour la culture de routine de la souche 12/1 à 37°C. Pour l’analyse IR et RP-HPLC, la bactérie a été cultivée à 37°C, 200 rpm dans un milieu de sel minimal (MSM) contenant (toutes les concentrations en mM) : K2HPO4, 10 ; MgSO4-7H2O, 1 ; sel disodique d’EDTA, 0,3 ; ZnSO4-7H2O, 0,01 ; MnSO4, 0,02 ; CuSO4-5H2O, 0,004 ; FeSO4-7H2O, 0,1 ; NaMoO4-2H2O, 0.004 ; (NH4)2SO4, 5 et 1% (p/v) d’un des hydrates de carbone suivants : glucose, fructose, ou sucrose (tous les composants ajoutés à partir des solutions mères concentrées autoclavées séparément). Le pH final du milieu a été ajusté à 10,5 en utilisant du NaOH 1 N.
2.2. Analyse de la croissance et du pH de la culture
1 mL de culture en phase logarithmique sur ABM a été utilisé pour inoculer des précultures (50 mL) (MSM contenant 1% de sucre). La culture d’essai réelle (250 mL de MSM dans un flacon Erlenmeyer de 500 mL) a été inoculée avec la préculture entière en phase logarithmique moyenne (D.O. ~ 1,2). Chaque ensemble de culture était composé de trois flacons. L’absorbance des échantillons à 650 nm a été utilisée comme mesure de la croissance bactérienne. Le pH a été déterminé dans les échantillons de culture sans cellules à température ambiante après centrifugation 4000 ×g pendant 20 min.
2.3. Analyse FT-IR
La culture a été récoltée après 60 h de croissance et a été centrifugée à 4000 ×g pendant 20 min. Pour l’analyse IR, le surnageant de la culture a été lyophilisé et broyé sous forme de poudre. Le surnageant en poudre a ensuite été mélangé avec du bromure de potassium, et le mélange a été pressé en comprimé. Enfin, le comprimé a été analysé en utilisant le spectromètre FT/IR-4200 (JASCO, Tokyo, Japon).
2.4. Analyse RP-HPLC
La culture a été récoltée à différents points de temps et a été centrifugée à 4000 ×g pendant 20 minutes. Pour l’analyse HPLC, le surnageant de culture a été filtré à travers un filtre de 0,22 μm, et 10 μL d’échantillon filtré ont été injectés dans la colonne HPLC.
L’acide formique, l’acide acétique, l’acide succinique, l’acide propionique, l’acide lactique et l’acide isobutyrique de qualité standard analytique ont été obtenus auprès de Sigma. Des solutions standard stock (100 mg/mL ou 100 μL/mL) ont été préparées et conservées à 4°C pour une utilisation ultérieure. Des solutions standard de travail (10 mg/mL ou 10 μL/mL) ont été préparées quotidiennement. De l’eau Milli-Q (Millipore) a été utilisée pour préparer les solutions tampon et les solutions mères de chaque composé et des échantillons. Les solutions mères, les échantillons et le tampon ont été filtrés sur des filtres à membrane en cellulose Whatman (0,45 μm, Whatman, Clifton, NJ, USA). Les solvants ont été dégazés sous vide avant utilisation.
L’analyse des acides organiques a été effectuée selon la méthode de Tormo et Izco . L’analyse a été réalisée sur un système Breeze (Waters, Mildford, MA, USA) composé d’une pompe HPLC binaire 1525, d’un passeur automatique 717 plus et d’un détecteur UV à deux canaux 2487 réglé à 210 nm, exploité à l’aide d’un logiciel Breeze. La séparation a été effectuée sur une colonne Atlantis dC18 (Waters) 250 × 4,6 × 5 μm. 20 mM de NaH2PO4 ajusté à pH 2,20 avec de l’acide phosphorique ont été préparés quotidiennement et filtrés à travers des membranes hydrophiles de 0,2 μm (Millipore). Le programme de solvants utilisait deux réservoirs contenant 1 % d’acétonitrile dans un tampon phosphate 20 mM ajusté à pH 2,20 avec de l’acide phosphorique (solvant A) et de l’acétonitrile (solvant B) ; le débit était réglé à 1,5 mL/min à température ambiante. Le programme de gradient a commencé avec 100 % de solvant A et après 7 min, le solvant B a été augmenté linéairement pour atteindre 7 % en 5 min. De 12 à 19 min, le taux a été maintenu à 93% du solvant A et 7% du solvant B. Après cela, le taux a été changé aux conditions de départ pour équilibrer la colonne pendant 15 min avant d’injecter à nouveau 10 μL de l’échantillon suivant.
3. Résultats
3.1. Analyse de la neutralisation sur milieu défini
Le milieu à sel minimal a été choisi pour l’analyse de l’acide organique produit par la bactérie en raison de sa nature définie et de sa source de carbone similaire aux eaux usées de l’industrie des boissons. On a laissé la bactérie se développer dans un milieu de sel minimal complété par différentes sources de carbone : glucose, fructose et saccharose. La figure 1 montre le profil de croissance et les caractéristiques du pH du milieu en fonction du temps. Le fructose et le saccharose ont permis une neutralisation beaucoup plus rapide du milieu par rapport au glucose. Le pH final obtenu avec le glucose était aussi légèrement plus élevé que celui obtenu dans le cas du milieu supplémenté en saccharose et en fructose. Ceci se reflète également dans le profil de croissance de la bactérie cultivée sur les trois sources de carbone. La bactérie s’est développée plus rapidement dans le saccharose suivi du fructose et du glucose.
(a)
(b)
(a)
(b)
Variation du pH (a) et de la O.D. (b) avec le temps sur le MSM. Les valeurs représentent la moyenne de trois mesures répétées, et les barres d’erreur représentent l’écart type.
3.2. Identification du groupe fonctionnel présent dans le surnageant de culture
Pour identifier le groupe fonctionnel large du métabolite produit par la bactérie afin de neutraliser les eaux usées alcalines, le surnageant de culture lyophilisé a été soumis à une spectroscopie FT-IR. Deux pics correspondant au groupe carbonyle (à 1644,98 cm-1) et au groupe hydroxyle (à 3436,74 cm-1) étaient présents dans le spectre (Tableau 1). Selon l’enquête bibliographique, la bactérie produit très probablement des acides organiques comme produit métabolique qui neutralise les eaux usées alcalines.
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3.3. Identification du produit métabolique spécifique de la bactérie
Afin d’identifier l’acide organique produit par la bactérie, une HPLC en phase inverse a été réalisée en utilisant des standards d’acides organiques connus sélectionnés après étude de la littérature. Les standards ont été analysés individuellement (Figure 2(a)) et en mélange (Figure 2(b)) afin de vérifier toute différence de temps de rétention due à l’interférence d’autres acides organiques dans le milieu. Le RT des acides organiques standard s’est avéré similaire dans les deux cas, la différence de temps de rétention ne dépassant pas 0,09 unité, sauf pour l’acide propionique (Tableau 2). Le surnageant de la culture a été analysé par la même méthode et on a constaté qu’il comprenait un seul pic avec un temps de rétention similaire à celui de l’acide formique. Ceci a été confirmé en dopant le surnageant avec de l’acide formique standard dont le pic s’est superposé à celui du produit dans le surnageant (Figure 2(d)).
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(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
RP-Chromatogrammes HPLC des acides organiques standard individuels (a), acides organiques standard en mélange (b), surnageant de culture (c), et surnageant de culture dopé à l’acide formique.
3.4. Analyse quantitative du produit métabolique de la bactérie
Pour l’analyse quantitative du surnageant de culture, différentes concentrations standard d’acide formique ont été réalisées, et la surface du pic correspondant à chaque concentration a été calculée. La surface du pic a été tracée en fonction de la concentration afin d’obtenir une courbe standard (Figure 3). Cette courbe standard a été utilisée pour calculer la quantité d’acide produite avec le temps sur un milieu de sel minimal complété par différentes sources de carbone. Le surnageant de culture de la bactérie a été analysé en fonction du temps et a été à nouveau soumis à une analyse HPLC en phase inverse. Il a été constaté que le pic du produit principal dans le surnageant de culture de la bactérie augmente avec le temps. Le temps de rétention de l’acide est similaire à celui de l’acide formique. L’étude de l’acide formique produit avec différentes sources de carbone en fonction du temps est présentée dans la Figure 4. La plus grande quantité d’acide a été produite dans le cas du MSM supplémenté en saccharose, suivi du fructose et du glucose.
Courbe standard pour la détermination de la concentration d’acide formique dans le surnageant de culture.
Variation de la quantité d’acide organique produite avec le temps sur MSM supplémenté avec différentes sources de carbone. Les valeurs représentent la moyenne de trois mesures répétées, et les barres d’erreur représentent l’écart type.
4. Discussion
La principale source de carbone dans l’effluent des eaux usées de l’industrie des boissons est le saccharose . Par conséquent, pour l’analyse du produit métabolique produit pendant la neutralisation, un milieu minimal de sel bien défini contenant du saccharose et les deux sucres monosaccharides constitutifs – glucose et fructose – ont été sélectionnés. Les caractéristiques de croissance de la souche 12/1 sur un milieu salin minimal supplémenté avec les trois sources de carbone montrent une neutralisation efficace concomitante à la croissance (Figures 1(a) et 1(b)). La diminution du pH du milieu de croissance est nécessairement due soit à la formation d’acides, soit à l’élimination de bases .
La production d’acides est bien documentée dans le cas de bactéries cultivées sur des sucres simples. Les produits métaboliques de certains membres alcaliphiles du genre Bacillus ont été étudiés. Dans ces études, le principal acide organique produit sur une source de carbone de type saccharose est l’acide acétique. Les séquences génomiques des espèces de Bacillus alcaliphiles – Bacillus pseudofirmus OF4, Bacillus halodurans et Bacillus clausii- confirment également cette observation, car toutes ces espèces possèdent une voie de conversion fonctionnelle du pyruvate en acétate. L’acide formique est un métabolite commun des bactéries neutrophiles dans des conditions anaérobies, tandis que B. circulans var. alkalophilus en produit jusqu’à 2 g/L même dans des cultures aérobies. D’autres acides volatils comme les acides propionique, butyrique, isobutyrique et isovalérique sont typiques des souches Bacillus alcalophilus ssp. halodurans, B. alcalophilus et Bacillus sp. 17-1. Les acides isobutyrique et isovalérique ont été signalés dans le milieu de plusieurs bacilles neutrophiles. Mais ces acides, ainsi que les acides propionique et butyrique, sont considérés comme provenant d’acides aminés d’après des études sur Clostridium sp. Les acides lactique et pyruvique sont assez fréquemment produits par les bacilles neutrophiles, mais la production d’acide succinique par Bacillus est rare. L’éthanol n’a pas été détecté dans les bacilles alcalins alors qu’il est un produit typique des cultures de glucose de nombreux bacilles neutrophiles. Ainsi, les conditions de croissance alcalines peuvent affecter la production des métabolites neutres .
Les études initiales sur les produits métaboliques dans le cas de bacillus sp. avaient été réalisées en utilisant la procédure titrimétrique . L’augmentation du pouvoir tampon du surnageant de la culture bactérienne autour de pH 5 qui est la gamme typique de protonation des acides carboxyliques a été utilisée pour émettre l’hypothèse que le milieu contient des acides carboxyliques. Dans cette étude, nous avons utilisé la spectroscopie FT-IR pour déterminer le groupe fonctionnel du ou des composés présents dans le surnageant de culture. Le spectrographe FT-IR a montré les pics caractéristiques du groupe carbonyle (à 1644,98 nm) et du groupe hydroxyle (à 3436,74 nm) (tableau 1), ce qui suggère la présence d’une espèce chimique constituée d’un groupe hydroxyle et d’un groupe carbonyle et qui est très probablement un acide carboxylique.
La méthode HPLC en phase inverse a été utilisée pour analyser les acides organiques présents dans le surnageant de culture . Les conditions HPLC ont été choisies pour la meilleure résolution rapportée, c’est-à-dire pH 2,2 et 1% d’acétonitrile. La méthode HPLC en phase inverse est avantageuse en raison de l’utilisation de colonnes moins coûteuses, de la manipulation plus facile des paramètres analytiques pour optimiser la séparation, et des analyses à température ambiante . La méthode a d’abord été utilisée pour calculer le temps de rétention des standards d’acides choisis selon l’étude de la littérature. L’ordre d’élution des acides dans ces conditions était le même que celui rapporté par Tormo et Izco , mais il y avait une variation dans les temps de rétention observés dans cette étude et ceux rapportés par Tormo et Izco . Cette variation peut être attribuée à la différence des conditions HPLC telles que la température 25-30°C dans cette étude contre 24°C ± 1°C rapportée dans Tormo et Iczo .
La RP-HPLC du surnageant de culture montre la présence d’un seul pic avec une absorbance à 211 nm qui est la longueur d’onde d’absorption caractéristique des acides organiques. Ainsi, le surnageant contient une seule espèce chimique qui est très probablement un acide organique. La comparaison du temps de rétention de ce pic et du temps de rétention des acides organiques standard montre que le temps de rétention est très similaire à celui de l’acide formique. Cette observation a été confirmée par l’ajout d’acide formique dans le surnageant de culture, ce qui augmente la surface du pic du produit (Figures 2(c) et 2(d)). La présence d’acide formique dans le surnageant de culture est conforme aux produits métaboliques de certains membres alcaliphiles du genre Bacillus ainsi que de certaines bactéries alcaliphiles anaérobies saccharolytiques telles que Halonatronum saccharophilum, Amphibacillus fermentum, et Amphibacillus tropicus .
La diminution maximale des unités de pH survenant par unité de temps rapportée jusqu’à présent chez les bactéries alcaliphiles est de 0,13 unité par heure dans le cas de Bacillus circulans var. alkalophilus, ce qui est assez faible par rapport à la diminution de plus de deux unités pendant la première heure d’inoculation rapportée dans cette étude. La forte diminution du pH indique une formation de produits de catabolisme acides. Cependant, le taux de diminution du pH seul n’indique pas l’augmentation de la concentration d’acides. Par conséquent, l’analyse quantitative des produits du métabolisme de la bactérie a été réalisée en utilisant la RP-HPLC. L’HPLC a été préférée à la GC car une comparaison des méthodes GC et HPLC pour la détermination des acides organiques dans les surnageants de culture des bactéries alcalophiles suggère que si la résolution des acides par GLC était excellente, la reproductibilité quantitative par HPLC était meilleure que par GLC . Comme prévu, la concentration d’acide produit a augmenté avec l’augmentation du temps d’incubation (Figure 4). En fait, la quantité d’acide a continué à augmenter bien après que le pH minimum ait été atteint. Ceci est en accord avec les études précédentes de production d’acide dans le cas de Bacillus sp. alcaliphiles facultatifs et obligatoires où la production d’acide a continué à augmenter même 30 heures après que le pH minimum ait été atteint. L’analyse comparative du produit métabolique produit dans des milieux supplémentés avec différentes sources de carbone montre que, bien que l’acide soit présent dans la même concentration finale, le taux de production d’acide était le plus élevé dans le cas du milieu supplémenté avec du sucrose, suivi du fructose et du glucose (Figure 4). Ceci est en accord avec les caractéristiques de croissance de l’organisme dans les milieux supplémentés avec ces sucres.
5. Conclusion
La souche 12/1 d’Exiguobacterium sp. neutralise le pH du milieu extérieur par la production d’acide organique à chaîne courte – acide formique. En gardant à l’esprit l’application potentielle de la bioremédiation à grande échelle des eaux usées alcalines, cette capacité de neutralisation des alcalins de la bactérie pour les eaux usées de l’industrie des boissons peut être considérée comme une première étape vers l’exploitation de son potentiel de commercialisation.
Remerciements
N. M. Kulshreshtha remercie la Commission des subventions universitaires pour sa bourse de recherche. Les auteurs sont immensément reconnaissants au Conseil de la recherche scientifique et industrielle, Inde, pour avoir fourni une plate-forme R&D et des installations pour cette recherche.