Les chromosomes sexuels des mammifères ont des rôles spécialisés dans le développement des cellules germinales mâles (XY) et femelles (XX) (1). Les anomalies des chromosomes sexuels sont la cause génétique la plus fréquente de l’infertilité humaine (2). Dans les trisomies des chromosomes sexuels (TCS), le syndrome de Klinefelter (XXY) et le syndrome du double Y (XYY), la spermatogenèse est perturbée par un excès de gènes X et Y, respectivement (2). Les hommes XYY sont généralement fertiles en raison de la perte spontanée du chromosome sexuel supplémentaire (mosaïcisme). Chez les hommes XXY, le mosaïcisme est moins fréquent. Le prélèvement de sperme testiculaire a permis la reproduction de certains jeunes hommes de Klinefelter mais est moins efficace chez les patients plus âgés (3, 4). Les individus XXY et XYY dépourvus de cellules germinales XY sont infertiles.

Pour étudier l’infertilité des SCT, nous avons généré des souris adultes XXY et XYY portant les transgènes rapporteurs fluorescents Blimp1-mVenus (BV) et Stella-ECFP (SC) (5) pour suivre la différenciation des cellules souches pluripotentes en cellules de type cellule germinale primordiale (PGCLC) (6). Les mâles XXY ont été créés en accouplant une femelle de type sauvage à un mâle variant de chromosome sexuel qui produit des spermatozoïdes contenant des XY (fig. S1). La génération de souris XYY nécessite l’héritage d’un chromosome Y des deux parents. Nous avons donc utilisé un chromosome Y de type sauvage hérité paternellement et un chromosome Yd1 hérité maternellement qui n’exprime pas le déterminant testiculaire Sry (fig. S1) (7). Comme cela a été montré précédemment (8, 9), le phénotype de la spermatogenèse dans les deux modèles récapitulait celui des hommes SCT, avec un arrêt au stade prospermatogonial chez les souris XXY et au stade pachynema chez les souris XYY (fig. S2). La spermatogenèse était normale chez les frères et sœurs transgéniques XY euploïdes BVSC.

Puis, nous avons établi des fibroblastes provenant de souris SCT et de souris XY et XX témoins (fig. 1A). L’hybridation in situ en fluorescence de l’ADN (DNA-FISH) pour le gène X Slx et le gène Y Sly a confirmé que les fibroblastes SCT et témoins du passage 4 (P4) avaient conservé leurs compléments chromosomiques sexuels d’origine (Fig. 1B et fig. S3A). Les fibroblastes ont été reprogrammés en cellules souches pluripotentes induites (iPSC) (10) de manière inductible par la doxycycline (Dox). Une DNA-FISH a été réalisée dans les iPSCs P2 résultantes (Fig. 1A).

Une forte proportion de lignées iPSC dérivées de SCT présentait une perte de chromosomes sexuels. A partir de souris XXY, nous avons observé des iPSCs XY, XX et XO (Fig. 1, C et E). L’incidence de la perte était similaire pour les chromosomes X et Y (P = 0,062, test de Mann-Whitney). A partir de souris XYY, nous avons observé des iPSCs XY et XO (Fig. 1, D et E). La perte du chromosome Y chez les mâles XYY s’est produite à une fréquence similaire à celle observée pour les chromosomes X et Y combinés chez les mâles XXY (P = 0,089, test de Mann-Whitney). Nous avons ensuite comparé l’incidence de la perte des chromosomes sexuels entre les iPSC dérivées de la GCS et les iPSC euploïdes dérivées de XY et XX. La perte de chromosomes sexuels était plus fréquente dans les iPSC dérivées de SCT que dans celles dérivées d’euploïdes (Fig. 1E), quel que soit le seuil utilisé pour définir la perte de chromosomes sexuels (fig. S12D).

La perte de chromosomes sexuels pourrait se produire pendant la reprogrammation des cellules SCT ou pendant la propagation des iPSC vers P2, conférant peut-être un avantage prolifératif aux cellules euploïdes résultantes. En effet, l’instabilité des chromosomes sexuels a été observée dans les cellules souches pluripotentes (11, 12). Pour tester cette dernière hypothèse, nous avons analysé la stabilité des chromosomes sexuels entre P2 et P6 dans des iPSCs avec des compléments hautement parentaux (>90%) (fig. S4A). Nous avons observé une perte de chromosomes sexuels dans les lignées d’iPSC XX et XXY (P < 0,01 et 0,05, respectivement ; test de Wilcoxon signé) mais pas dans les lignées d’iPSC XY et XYY (P = 0,21 et 0,66, respectivement ; test de Wilcoxon signé). Cependant, aucune lignée iPSC ne présentait une diminution de plus de 15 % du complément parental (fig. S4B). De plus, la perte de chromosomes sexuels entre P2 et P6 n’était pas basée sur la trisomie (fig. S4B). Les iPSC XY euploïdes dérivées de SCT ne présentaient pas non plus d’avantage prolifératif par rapport aux iPSC XXY ou XYY (fig. S5). Les fibroblastes SCT étant également stables d’un point de vue caryotypique (fig. 1B et fig. S3A), la perte de chromosomes est probablement induite pendant la reprogrammation des iPSC et est donc distincte de l’instabilité des chromosomes sexuels dans les cellules souches pluripotentes (11, 12). Nous appelons ce phénomène la perte de chromosomes liée à la trisomie (TCL).

Nous avons ensuite déterminé si les iPSC XY euploïdes dérivées de fibroblastes SCT formeraient des spermatozoïdes fonctionnels. Nous avons sélectionné des iPSC P6 hautement euploïdes (≥80% des cellules XY) adaptées au milieu sans Dox (fig. S6). Pour nos expériences XYY, seules les lignées iPSC XY qui conservaient le chromosome Y de type sauvage plutôt que le chromosome Yd1 ont été utilisées pour les expériences PGCLC (fig. S7). Le caryotypage a confirmé que toutes les lignées iPSC XY dérivées du SCT et une lignée iPSC XY témoin étaient euploïdes (fig. S8). Ces lignées iPSC ont été différenciées (6) par un état semblable à celui d’un épiblaste pour créer des agrégats PGCLC positifs pour BV et SC (Fig. 2A). Les PGCLC positifs pour BV (tableau S1) ont été isolés par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) (Fig. 2B) et transplantés dans des testicules W/Wv (mutant Kit) déficients en cellules germinales (13).

La spermatogenèse des receveurs a été évaluée 9 à 10 semaines après la transplantation. Les tératomes, qui sont observés après la transplantation de PGCLC dérivés d’iPSC (6), étaient présents dans 29 % des lignées transplantées dérivées de XXY et 50 % de celles dérivées de XYY (fig. S9). La reconstitution de la spermatogenèse, révélée par la présence de colonies spermatogènes (Fig. 2C) et par l’histologie (Fig. 2D), a été observée pour toutes les lignées iPSC dérivées de XXY et XYY utilisées (Tableau 1). Ainsi, les iPSC XY dérivées de SCT peuvent se différencier en cellules germinales in vitro et compléter la spermatogenèse après la transplantation.

Nous nous sommes demandé si les spermatozoïdes créés via la transplantation pouvaient soutenir la reproduction. L’injection intracytoplasmique de spermatozoïdes (ICSI) à l’aide de spermatozoïdes provenant de deux lignées iPSC XXY- et de deux lignées iPSC XYY dérivées de XY (Fig. 2E et fig. S10A) a généré des zygotes qui se sont développés en embryons à deux cellules in vitro (efficacité 76.7 à 87,3 %) (Fig. 2F, fig. S10B et tableau S2) et une progéniture tout à fait normale lorsqu’elle a été transplantée dans des receveurs (efficacité 46,9 à 59,4 %) (Fig. 2G, fig. S10C et tableau S2). Le génotypage par réaction en chaîne par polymérase a confirmé que la progéniture était issue des PGCLC transplantés (fig. S10D). Les chiots issus des lignées iPSC dérivées de XXY et XYY ont présenté une croissance comparable à celle des chiots issus des iPSC XY témoins (fig. S10E). Notamment, les petits issus des lignées XXY- et XYY avaient des compléments euploïdes (XY ou XX) (fig. S11). Trois mâles matures et trois femelles de chaque lignée iPSC dérivée de XXY et XYY ont été accouplés entre eux, et tous étaient fertiles (Fig. 2H et fig. S10F). Ainsi, les spermatozoïdes provenant d’iPSC XY dérivées de SCT donnent naissance à une progéniture chromosomiquement normale, saine et fertile.

Nous avons cherché à savoir si la TCL est spécifique de la trisomie des chromosomes sexuels. Parce que des modèles de souris avec une trisomie pour un autosome complet ne sont pas disponibles (14), nous avons répété nos expériences chez des souris transchromosomiques Tc1 mâles, un modèle de syndrome de Down avec un chromosome 21 humain accessoire (hChr.21) (15). Les souris Tc1 portent une cassette de résistance à la néomycine insérée dans le hChr.21, dont la sélection réduit le mosaïcisme du hChr.21 (15). Nous avons donc d’abord enrichi les fibroblastes adultes Tc1 pour la présence de hChr.21 en utilisant l’analogue de la néomycine G418 (Fig. 3A). L’ADN-FISH a montré que la grande majorité (≥96%) des fibroblastes Tc1 conservait hChr.21 (Fig. 3B et fig. S3B). Ces fibroblastes Tc1 ont été reprogrammés sans sélection G418, et les iPSCs résultantes ont été analysées à P2. Dix des 16 lignées iPSC générées (62,5 %) présentaient une perte de hChr.21 dans ≥10 % des cellules (Fig. 3, C et D, et fig. S12D). En revanche, après l’élimination du G418, la hChr.21 était conservée dans les fibroblastes Tc1 cultivés pendant la même période que celle utilisée pour la reprogrammation des iPSC (18 jours) et dans les lignées iPSC P6 qui présentaient des compléments hautement parentaux (>90 % de hChr.21 positifs) à P2 (fig. S12, A et B). Nous concluons que la perte de hChr.21 dans les cellules Tc1 est favorisée par la reprogrammation plutôt que par l’élimination du G418 et donc que le TCL affecte également un chromosome accessoire.

Nous avons ensuite demandé si le TCL se produit dans les cellules humaines. Des cas de perte de chromosomes ont été observés pendant la culture de cellules trisomiques humaines (16, 17), mais leur prévalence et leur relation avec la reprogrammation n’ont pas été systématiquement analysées. Nous avons sélectionné des lignées de fibroblastes humains atteints du syndrome de Klinefelter, du syndrome de Down et de fibroblastes euploïdes XY et XX présentant un mosaïcisme minimal (fig. S13, A et D), nous les avons reprogrammées et nous avons déterminé les compléments chromosomiques des lignées iPSC résultantes. Nous avons observé des iPSC XY et XX à partir de fibroblastes atteints du syndrome de Klinefelter et des iPSC euploïdes à partir de fibroblastes atteints du syndrome de Down (fig. S13, B, C, F et G). La perte de chromosomes était plus fréquente dans les cellules trisomiques que dans les cellules disomiques, ce qui démontre que le TCL se produit également au cours de la reprogrammation humaine. Cependant, la fréquence des lignées iPSC hautement euploïdes était inférieure à celle observée dans les iPSC de souris dérivées de trisomies (fig. S13, F à H).

Nous avons montré que la TCL produit des iPSC euploïdes à partir de souris et de patients SCT et trisomiques autosomiques (fig. S12E). Chez la souris, les iPSC « corrigées » résultantes peuvent former des spermatozoïdes fonctionnels, permettant la production d’une descendance chromosomiquement euploïde à partir d’individus SCT infertiles. Le TCL complète les thérapies iPSC existantes pour les anomalies chromosomiques (17-21). Les mécanismes à l’origine de la TCL sont inconnus. Les stress cellulaires associés à la reprogrammation peuvent sélectionner les cellules trisomiques, permettant l’émergence de cellules euploïdes. Nous avons observé des TCL moins fréquents dans les cellules humaines que dans les cellules de souris (figs. S12D et S13H). Même s’ils sont rares, les TCL pourraient offrir des traitements aux patients infertiles atteints de GCS pour lesquels les autres approches sont infructueuses. Cependant, l’utilisation clinique de cellules germinales humaines fabriquées in vitro doit être soigneusement étudiée sur le plan éthique et juridique (22-24). En outre, une spermatogenèse in vitro complète devra être développée pour éviter le risque de formation de tératome résultant de la transplantation de cellules germinales.

La LCT permet également de produire des iPSC femelles à partir de mâles, offrant un potentiel pour la dissection génétique des dimorphismes sexuels (25). En créant des lignées d’iPSC isogéniques qui ne diffèrent que par leurs chromosomes sexuels, les différences de sexe identifiées lors de la modélisation des maladies des iPSC pourraient être attribuées aux effets des chromosomes X ou Y.