Les protéines doivent interagir avec d’autres protéines pour former des complexes fonctionnels. Dans de nombreux cas, la fonction des protéines à l’intérieur des cellules ne peut être comprise sans informations sur la structure de la protéine et sans savoir dans quel complexe la protéine se trouve.1, 2 Ceci est, par exemple, d’une importance capitale pour les protéines qui modulent les informations épigénétiques sur l’ADN. Presque toutes ces protéines modificatrices de la chromatine nécessitent une interaction intensive avec des enzymes métaboliques, qui fournissent les cofacteurs nécessaires à l’acétylation, la désacétylation ou la méthylation et la déméthylation des histones.3-5 Cela montre la nécessité d’étudier l’environnement complexe d’une protéine donnée pour analyser sa fonction et son état d’activité. La réticulation des protéines, combinée à l’analyse par spectrométrie de masse (XL-MS), est une méthode idéale pour obtenir des informations sur la structure des protéines et la composition des complexes protéiques.6-9 Pour la XL-MS, des réactifs chimiques spécialisés, les réticulants, sont nécessaires, car ils sont capables de connecter de manière covalente des résidus protéiques qui sont très proches, par exemple, en interaction dans un complexe.10, 11 La caractérisation des peptides réticulés au moyen de la spectrométrie de masse, cependant, pose un formidable défi pour deux raisons. Premièrement, l’identification de la réticulation doit être réalisée en analysant les ions fragments non pas d’un, mais de deux peptides connectés, ce qui complique considérablement les spectres MS2. Deuxièmement, les espèces de peptides réticulés n’ont qu’une très faible abondance et font partie d’un mélange de peptides qui est dominé de manière écrasante par des peptides non réticulés. Dans de nombreux cas, cela entraîne une perte d’information considérable qui entrave l’identification précise des réticulations et, par conséquent, l’analyse de l’interactome. Quelques réactifs de réticulation ont été développés, qui ont introduit des groupes clivables par MS, et la possibilité d’un enrichissement XL pour résoudre ces problèmes.12-18

Dans ce document, nous rapportons le développement d’un nouveau réactif de réticulation qui est enrichissable et a des propriétés de clivage qui permettent une identification précise des réticulations. Le cliXlink conçu (1) est représenté sur la figure 1. Le réactif perméable aux cellules (figure 1 A et figure S1 dans les informations complémentaires) comporte deux unités d’ester succinimidylique qui peuvent réagir avec les nucléophiles des protéines et qui sont espacées d’environ 9 Å ; ce qui permet de fixer de courtes distances pour obtenir des informations structurelles sur les protéines et de capturer des protéines très proches les unes des autres. La clivabilité efficace de la MS est assurée par le groupe sulfoxyde bien établi, qui peut être clivé dans des conditions de dissociation induite par collision (CID) à faible énergie avant la fragmentation du peptide. En outre, une unité alcyne permet à une fraction d’enrichissement, par exemple, la biotine, d’être attachée aux sites réticulés à l’aide de la réaction CuAAC.19

L’application du réticulant peut suivre le flux de travail décrit dans la Figure 1 B. Elle implique l’addition du réactif 1 à un protéome complexe, fixant les informations de distance de l’état natif des peptides à proximité immédiate et les préservant tout au long du flux de travail ultérieur pour l’analyse MS. La fixation du groupe d’affinité pour l’enrichissement est effectuée après la réticulation pour éviter l’interférence des groupes d’enrichissement volumineux. En modifiant les peptides réticulés au niveau des protéines, les réactifs à petites molécules en excès peuvent être facilement éliminés par précipitation à l’acétone. Cette opération est suivie d’une digestion enzymatique des protéines. Les peptides réticulés sont ainsi marqués, par exemple à la biotine, ce qui permet de les enrichir. Ensuite, ils sont analysés au moyen de la spectrométrie de masse. Étant donné que les masses des peptides individuels dans une réticulation ne sont pas immédiatement accessibles, l’attribution de la réticulation est difficile, en particulier dans les échantillons complexes. Cela nécessite l’utilisation de réactifs clivables par MS, qui facilitent l’identification MS2 en formant des ions fragments spécifiques.20, 21 Dans le meilleur des cas, le réactif doit également permettre des expériences MS3, ce qui nécessite que le réticulant soit clivé avant les peptides. Cela permet de séparer les peptides pour une identification individuelle par MS3. Notre réactif 1 contient des atomes d’hydrogène β des deux côtés du sulfoxyde, de sorte que la fragmentation se produit dans deux directions, comme le montre la figure 1 C. Cela conduit à une séparation nette des peptides (α, β) et génère deux fragments pour chaque peptide : un alcène et un fragment d’acide sulfénique ; ce dernier forme un thial lors de la perte d’eau. On obtient ainsi deux couples de masse avec un Δm/z≈32 caractéristique. De manière importante, nous avons observé que la voie de fragmentation a (figure 1 C) prédominait. Par conséquent, pour le α-peptide, le fragment alcène, et pour le β-peptide, le fragment thial, sont les principaux produits de clivage. En raison des propriétés de clivage asymétrique, la plupart de l’intensité du signal est conservée sur un fragment par peptide, ce qui devrait fournir une excellente sensibilité dans les expériences MS3.

La synthèse du réactif 1 est simple (Schéma 1). Le point de départ est le dimère disulfure oxydé de l’homocystéine 2, qui est traité avec de l’acide 4-pentynoïque pour donner le disulfure 3. Le clivage réducteur du disulfure et l’alkylation des thiols générés avec le 3-bromopropionate de méthyle génèrent le composé sulfuré 4. La saponification des deux esters méthyliques en 5 et la conversion de 5 en ester bissuccinimidylique activé 6, suivie de l’oxydation du thioéther en sulfoxyde, donne le réactif 1 avec un rendement total de 16 %. Il est particulièrement important que le réactif soit très pur et que les unités ester réactives soient en place des deux côtés. L’hydrolyse partielle doit être évitée. Ceci a été assuré par une purification finale par précipitation. Le réactif 1 a été dissous dans un mélange d’acétate d’éthyle et de dichlorométhane et précipité par addition d’hexanes.

Nous avons ensuite étudié les propriétés MS de 1. À cette fin, nous avons ajouté 1 à la protéine modèle couramment utilisée, l’albumine de sérum bovin (BSA). Nous avons suivi le flux de travail décrit dans la figure 1 B sans effectuer l’étape d’enrichissement. En bref, après l’ajout de 1 à la solution protéique et la réaction pendant 1 h à température ambiante et à pH physiologique, nous avons précipité la protéine avec de l’acétone, l’avons remise en suspension dans un tampon (voir les informations complémentaires) et avons digéré la protéine par la suite avec un mélange de trypsine et de Lys-C.

Le mélange peptidique obtenu a été dessalé avec des colonnes C18 Tip et analysé au moyen de la HPLC-MS2 (Figure 2). La figure 2 A montre deux peptides de BSA réticulés (α+β) à titre d’exemple. Après avoir déterminé la masse exacte de la réticulation intacte (m/z 677,1 ; Figure 2 B), nous avons effectué une fragmentation CID et HCD sur le précurseur pour évaluer les propriétés de fragmentation (Figure 2 C). La fragmentation CID plus sélective (excitation par résonance de l’ion de réticulation ; Figure 2 C, spectre supérieur) à une faible énergie de collision normalisée de 25 % ne fournit, comme prévu, qu’un petit ensemble de signaux intenses. Deux paires de signaux proéminents, avec Δm/z de 32 (Δmrep), sont obtenues en raison de la fragmentation du réticulant, qui donne lieu à un fragment thial (α-/β-thial) et alcène (α-/β-alcène) pour chaque peptide. Comme mentionné précédemment, la voie de fragmentation a (Figure 1 C) est privilégiée, ce qui conduit à une distribution d’intensité asymétrique. La formation dominante des peptides intacts et séparés attendus rend par conséquent le réactif utilisable pour des expériences MS3 plus sophistiquées.

Pour notre étude, nous avons utilisé la fragmentation HCD. Cette méthode permet le clivage simultané du réticulant et la formation des fragments peptidiques nécessaires à l’identification (Figure 2 C, spectre inférieur). Pour faciliter la reconnaissance réticulant/peptide, il est important que la fragmentation HCD fournisse toujours les fragments alcène et thial. Les données HCD permettent donc l’identification des peptides par MS2.

En utilisant cette méthode, nous avons analysé les données avec le logiciel gratuit MeroX, en filtrant strictement toutes les identifications de réticulation (score >50, taux de fausse découverte (FDR) 1 %) et en exigeant la présence d’au moins trois des quatre ions des deux paires de masse caractéristiques.23, 24 Sans exploiter la possibilité d’enrichissement à base de CuAAC, nous avons pu identifier 61 réticulations uniques de BSA en une seule mesure (Figure 2 D).25 Ce résultat est représentatif des mesures effectuées avec de la BSA purifiée dans notre laboratoire. Ce résultat est représentatif des mesures effectuées avec de la BSA purifiée dans notre laboratoire. De plus, nous avons représenté les liaisons transversales trouvées dans la structure cristalline de la BSA et avons noté que la majorité des distances mesurées étaient raisonnables. Il est important de noter que les réticulations montrent une distance Cα-Cα moyenne entre les acides aminés réticulés de 22,1 Å et une distribution des distances qui est en parfait accord avec ce qui est attendu pour une réticulation avec un réactif qui espace les esters actifs d’environ 9 Å (Figures 2 E et S2)26 et en prenant en compte les longueurs des chaînes latérales et la dynamique moléculaire des protéines.27 La réticulation a eu lieu principalement entre deux résidus Lys (49 %), mais nous avons également détecté des connexions Lys-Thr (30 %), Lys-Ser (13 %) et Lys-Tyr (8 %), en accord avec la réactivité des esters succinimidyliques (Figure 2 F).28

Ce succès nous a permis de valider le nouveau réticulant dans un environnement plus complexe. Nous voulions notamment montrer la valeur supplémentaire de la possibilité d’enrichissement basée sur le CuAAC. Pour cette expérience, nous avons à nouveau réticulé la protéine BSA (10 μg), l’avons précipitée avec de l’acétone, avons redissous la protéine réticulée et avons ensuite réalisé la réaction click (Figure S3 A) en ajoutant 7 (Figure 3 A) et CuSO4/tris(3-hydroxypropyltriazolylméthyl)amine (THPTA), suivie de la réduction de CuII en CuI lors de l’ajout d’ascorbate de sodium. Après 1 h à température ambiante, nous avons effectué une autre précipitation à l’acétone pour éliminer l’excès d’azoture de biotine. Nous avons ensuite ajouté de la trypsine et du Lys-C pour la digestion.

Ces peptides, nous les avons ensuite combinés avec un digest protéique obtenu à partir d’un extrait de cellules HEK (435 μg de protéines ; Figure 3 B). Cela crée un fond massif de peptides non réticulés. Si nous analysons maintenant les réticulations au sein de ce grand fond (Figure 3 C), nous n’avons identifié qu’un très petit nombre de correspondances spectrales de réticulation (moyenne CSMs=5,0), de sites réticulés uniques (moyenne unique XLs=3,7) ainsi que de monoliens (moyenne=5,3), dans lesquels un ester succinimidylique s’est hydrolysé avant la réaction avec la protéine. Cependant, si nous avons effectué l’enrichissement avec des billes magnétiques recouvertes de streptavidine, le nombre d’identifications de réticulation s’est considérablement amélioré. Après l’incubation du mélange de peptides avec les particules magnétiques, le lavage intensif (6×) des billes avec un tampon (voir les informations complémentaires) et le clivage réducteur doux du disulfure pour libérer les liaisons croisées  » capturées  » et ainsi éliminer la partie biotine (Figure S3 B), nous avons maintenant, en moyenne, détecté 95,0 CSM et 37,0 XL uniques ainsi que 184,3 liaisons simples. Le nombre de XL uniques identifiés était inférieur à celui de la BSA purifiée (Figure 2 D), ce qui pourrait être expliqué par des inefficacités dans la réaction CuAAC ou par l’interférence du fond de complexe non réticulé. Cependant, ce résultat montre que notre nouvel agent de réticulation, 1, est capable d’enrichir les peptides réticulés dans un vaste excès de peptides non modifiés ; facilitant ainsi l’analyse d’échantillons complexes avec des réticulations peu abondantes. A l’origine, nous étions sceptiques quant à la structure asymétrique de 1. Les données montrent cependant que, malgré cela, un grand nombre de réticulations sont identifiées.

En résumé, notre nouveau réticulant 1 combine les avantages suivants : tout d’abord, la taille du réactif est idéalement adaptée pour obtenir des informations de distance précieuses pour la protéomique structurelle. De plus, la molécule est perméable aux cellules et l’unité alcyne ne provoque pas d’interférence majeure avec la réaction de réticulation. En outre, la fragmentation robuste et efficace du sulfoxyde simplifie l’identification des réticulations. La possibilité de fonctionnaliser les peptides réticulés avec 1 par chimie click permet d’employer diverses modifications et stratégies d’enrichissement qui permettent d’analyser les réticulations peu abondantes. En conclusion, notre réactif 1 ouvre désormais la voie à l’analyse d’interactomes complexes en utilisant des expériences MS2 et MS3.

Conflit d’intérêt

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt.