Génération de souris knockout

Les technologies utilisées pour générer des souris knockout comprennent la recombinaison homologue (ou ciblage génétique) et le piégeage génétique. Les deux approches impliquent l’utilisation de cellules souches embryonnaires (ES) de souris qui sont isolées à partir d’embryons de souris à environ quatre jours après la fécondation. Dans la première approche, la recombinaison homologue, un ADN artificiel dont les séquences flanquantes sont homologues (identiques) à celles qui se trouvent en amont et en aval de la séquence d’ADN du gène cible est introduit dans le noyau d’une cellule ES de souris. La cellule ES reconnaît les séquences flanquantes homologues et échange l’ADN du gène cible existant contre des segments de l’ADN étranger. L’ADN étranger est cependant inactif. Ainsi, son incorporation dans le génome de la cellule ES inactive, ou élimine, le gène cible. L’ADN étranger est généralement modifié pour porter un gène rapporteur, qui marque l’emplacement du gène existant, ce qui permet aux chercheurs de suivre sa présence dans le génome de la cellule de souris au fur et à mesure que les cellules se répliquent. La recombinaison homologue est la méthode de choix lorsqu’il est nécessaire qu’un allèle (gène) spécifique soit remplacé par une séquence d’ADN modifiée sans affecter les autres gènes du génome.

Le piégeage des gènes utilise également de l’ADN artificiel qui porte un gène rapporteur. Cependant, plutôt que de cibler un gène spécifique, l’ADN étranger est incorporé de manière aléatoire dans n’importe quel gène du génome des cellules ES de souris. La séquence étrangère empêche le gène perturbé de coder ses produits protéiques, rendant ainsi le gène inactif. L’activation du gène rapporteur lors de son incorporation dans le génome de la cellule ES permet aux chercheurs de suivre l’activité du gène et de déduire la fonction du gène perturbé.

Les séquences d’ADN artificielles sont généralement introduites dans les cellules ES de souris à l’aide d’un rétrovirus ou d’un autre vecteur viral, et les cellules ES modifiées sont ensuite cultivées dans des cultures cellulaires. Après quelques jours, les cellules sont injectées dans des embryons précoces de souris, qui sont ensuite implantés dans l’utérus d’une femelle de substitution, où ils se développent finalement et sont portés à terme. Les souriceaux nés de cette manière contiennent à la fois des tissus modifiés et non modifiés et ne sont donc pas des souris knock-out complètes. Afin de générer une paire de véritables souris knock-out (knockouts homologues), les souris doivent être croisées sur plusieurs générations. Initialement, les animaux sont croisés avec d’autres souris pour produire des individus hétérozygotes (souris avec une copie du gène cible) ; les animaux hétérozygotes sont ensuite croisés pour produire des homozygotes.