γδ-selection

Les cellules γδT émergent des thymocytes DN, car le réarrangement des chaînes TCRγ et δ se produit dans les stades DN . Les cellules précurseurs γδ, qui ont un TCRγ et δ réarrangé avant la recombinaison du TCRβ, expriment le complexe γδTCR/CD3 sur la membrane plasmique, où le γδTCR s’auto-oligomérise, comme le pré-TCR, et initie des voies de signalisation intracellulaires . Ce signal γδTCR induit le processus appelé  » γδ-sélection « , qui confirme la génération de chaînes TCRγδ fonctionnelles, faisant reconnaître à la cellule que  » je suis une cellule γδT  » .

Le signal γδ-sélection déclenche la différenciation des cellules précurseurs γδ CD5- CD24high en cellules γδT commises CD5+ CD24low . La transition des cellules γδT CD5- à CD5+ est nettement altérée chez les souris déficientes en Syk, tandis que les souris déficientes en Zap70 présentent une différenciation normale des cellules γδT CD5+. Les souris doublement déficientes en Zap70/Syk présentent un arrêt complet de la différenciation des cellules γδT au stade de précurseur CD5-. Ainsi, la sélection des γδ dépend principalement du signal médié par Syk, et Zap70 ne joue qu’un rôle mineur et redondant dans ce processus. Ce mécanisme est tout à fait analogue à celui de la β-sélection. Une cible critique de Syk dans le signal de sélection γδ est le signalosome Lat, car les souris déficientes en Lat présentent une inhibition complète de la sélection γδ et un manque total de cellules γδT matures.

Les cellules précurseurs deγδ provenant de souris déficientes en Syk/Zap70 ou de souris déficientes en Lat ne peuvent être distinguées des cellules de la lignée αβT par l’expression de leurs protéines de surface cellulaire, à l’exception de la γδTCR, et conservent toujours le potentiel de se différencier en cellules αβT. Qu’est-ce qui détermine le destin de différenciation dans le lignage αβT ou γδT à partir du précurseur ? Cette question a été abordée par des études utilisant des souris transgéniques γδTCR. Lorsque le signal γδTCR est affaibli par une déficience soit des protéines de signalisation, soit des ligands endogènes pour le γδTCR transgénique, les cellules précurseurs ont donné naissance à des cellules DP du lignage αβT au détriment des cellules du lignage γδT . Ces résultats suggèrent qu’un signal plus fort (probablement lors de l’interaction γδTCRligand) conduit à l’engagement vers les cellules γδT, tandis qu’un signal plus faible (probablement par pré-TCR indépendant du ligand) conduit à la différenciation αβT. Cependant, des expériences utilisant une autre souche de souris transgénique exprimant γδTCR avec la même spécificité de ligand ont démontré que les cellules γδT étaient capables de mûrir en l’absence des ligands . Chien et ses collègues ont utilisé une méthode de coloration tétramérique pour identifier la population de cellules γδT spécifiques du ligand afin d’examiner l’importance des ligands γδTCR endogènes chez les souris non transgéniques. Les résultats ont clairement montré que le nombre de cellules γδT spécifiques du ligand était comparable entre les souris déficientes et non déficientes en ligand, ce qui suggère que la majorité des cellules γδT n’ont pas rencontré de ligands pendant la différenciation thymique. Les auteurs ont également fourni des preuves que certains γδTCRs peuvent signaler de manière indépendante du ligand. Ces observations contredisent évidemment le modèle précédent selon lequel l’engagement de la lignée γδT nécessite une interaction avec le ligand γδTCR. Étant donné que les cellules γδT polyclonales réactives à certains ligands exogènes se différencient et mûrissent fonctionnellement dans le thymus, il est probable que les observations dans certaines lignées de souris transgéniques γδTCR ne reflètent pas la majorité des cellules γδT avec des γδTCR polyclonaux.

Pour examiner l’impact du signal de sélection γδ sur la différenciation αβT/γδT, nous avons utilisé des souris déficientes en Lat, dans lesquelles la différenciation des cellules γδT est arrêtée au stade de précurseur CD5-. Les cellules précurseurs γδTCR+ ont été purifiées à partir de souris adultes déficientes en Lat, infectées par des rétrovirus exprimant Lat, et cultivées sur des monocouches de cellules stromales (Fig. 2a). Cette expérience permet une évaluation directe du phénotype cellulaire avant et après la sélection γδ dans une condition sans ligand. Comparées aux cellules témoins non transduites, les cellules γδT exprimant Lat ont montré une induction marquée de l’expression de surface de CD5 (Fig. 2b), ainsi que l’expression de l’ARNm des gènes de signature des cellules γδT (Tcrd, Egr3, Runx3, et Bcl-2), et l’abrogation complète de la transcription des gènes associés aux cellules DN précurseurs et aux cellules αβT (Rag1, Rag2, et Ptcra) (Fig. 2c). Ces résultats indiquent que le signal γδTCR entraîne à la fois la différenciation vers le lignage γδT et réprime la différenciation vers le lignage αβT de manière indépendante du ligand.

Ensemble, bien que les mécanismes soient encore insaisissables (et débattus) par lesquels le pré-TCR et le γδTCR dirigent les processus de différenciation dans les lignées αβT et γδT, respectivement, il est probable que la sélection γδ, au moins dans la majorité des cellules γδT générées naturellement, ne dépende pas du ligand γδTCR cognat dans le thymus.

L’intensité du signal γδTCR détermine la différenciation γδT17/γδT1

Pendant le développement des lignées αβT et γδT, l’expression de Syk et de Zap70 est inversement régulée : Syk est fortement exprimée dans les stades précoces (DN1-3 et précurseur γδ) et régulée à la baisse par la suite, tandis que Zap70 est exprimée dans les stades ultérieurs (après la β-sélection ou la γδ-sélection) . Les cellules γδT qui sont passées par la γδ-sélection expriment des niveaux élevés de Zap70 ainsi que des complexes γδTCR/CD3 et peuvent répondre à des ligands endogènes s’ils sont fournis dans le thymus. Il est actuellement reconnu que contrairement aux cellules αβT, les cellules γδT ne subissent pas de sélection positive induite par les ligands ou de délétion clonale dans le thymus. Plusieurs études ont suggéré que l’interaction ligand γδTCR dans le thymus contrôle plutôt la fonction effectrice des cellules γδT.

En utilisant la coloration tétramérique d’une population de cellules γδT réactives aux molécules non classiques du CMH de classe I T10 et T22, le groupe de Chien a constaté que les cellules γδT naïves d’antigène qui se développent en l’absence des ligands produisent préférentiellement de l’IL-17, alors que les cellules γδT expérimentées d’antigène qui se développent en présence des ligands produisent principalement de l’IFNγ . Cette étude a d’abord suggéré l’idée qu’un signal γδTCR fort induit par un ligand et un signal γδTCR faible induisent des cellules γδT1 et γδT17, respectivement. Une étude récente avec des souris déficientes T10/T22 nouvellement générées a rapporté essentiellement les mêmes résultats, soutenant ce « modèle de force du signal » . Ce modèle a également été soutenu par d’autres études. La maturation thymique et la différenciation effectrice des cellules Vγ5Vδ1 γδT nécessitent Skint1 (et probablement d’autres protéines de la famille Skint), une protéine costimulatrice putative pour le TCR Vγ5Vδ1. En l’absence de Skint1, les cellules Vγ5Vδ1 γδT sont mal orientées vers un phénotype de cellules γδΤ17 aux dépens du phénotype de cellules γδΤ1 . En outre, le développement des cellules γδT1 nécessite également une costimulation via CD27, une protéine de la superfamille des récepteurs du TNF exprimée dans les cellules γδT1, mais pas dans les cellules γδT17 . Plus récemment, le groupe de Pennington a identifié des cellules γδT thymiques bipotentes (CD24lo CD44lo CD45RBlo) qui peuvent donner naissance à la fois aux cellules γδT17 et aux cellules γδT1. Dans la culture d’organes de thymus fœtal, le développement des cellules γδT17 a été inhibé par de forts signaux TCR induits par la stimulation avec des anticorps anti-TCRδ ou anti-CD3ε, mais ces effets ont été abrogés par l’inhibition pharmacologique de la voie MEK/ERK . Ces données fournissent des preuves directes à l’appui de l’idée que la force du signal γδTCR est un déterminant critique de la fonction effectrice des cellules γδT.

Au niveau transcriptionnel, le fort signal γδTCR induit l’expression de régulateurs transcriptionnels associés à γδT1, tels que Egr2, Egr3 et Id3, ce qui entraîne un destin cellulaire γδT1 . Id3 inhibe l’adoption du destin cellulaire γδT17 en inhibant la régulation transcriptionnelle médiée par HEB (codé par Tcf12) . HEB peut se lier directement en amont des sites de début de transcription de Sox4 et Sox13 pour promouvoir leur expression. Ces facteurs de transcription associés à γδT17 sont nécessaires à l’expression du facteur de transcription essentiel RORγt (codé par Rorc) et de la protéine de signalisation Blk . Compte tenu de ces faits, le modèle de force du signal TCR démontre clairement les mécanismes par lesquels le signal TCR contrôle la fonction effectrice des cellules γδT.

Toutefois, une série d’études a démontré l’impact de l’ablation génétique des molécules de signalisation TCR sur la fonction effectrice des cellules γδT, remettant en question l’idée que la force du signal γδTCR détermine à elle seule le destin de différenciation γδT17/γδT1. Les souris mutantes Zap70 W163C présentent une perte complète du développement des cellules γδT17 Vγ6+ mais ont un développement normal des cellules γδT1, alors que les signaux TCR sont atténués chez ces souris . Une autre étude menée par Silva-Santos et ses collègues a montré que les souris haplo-insuffisantes pour CD3δ et CD3γ (CD3DH), qui présentaient une plus faible expression à la surface des cellules des complexes γδTCR/CD3 et une signalisation γδTCR altérée, ont montré une réduction marquée du développement thymique des cellules γδT17 Vγ6+ ainsi que des cellules γδT1, mais pas des cellules γδT17 Vγ4+, ce qui indique que les sous-ensembles γδT17 ont besoin d’une force de signal γδTCR distincte pour leur développement. Bien que le développement des cellules αβT et la transduction du signal αβTCR n’aient pas été affectés chez les souris CD3DH, cette souche de souris est le seul modèle animal à ce jour dans lequel l’inhibition spécifique de la signalisation γδTCR a été démontrée. On ne sait toujours pas pourquoi les cellules γδT sont spécifiquement affectées chez les souris CD3DH, mais il est probable que la composition distincte des complexes TCR-CD3 des cellules αβT et γδT explique le phénotype unique des souris CD3DH. Dans ce contexte, il convient de noter que les souris avec la mutation CD3ε C80G, qui est incapable d’induire des changements conformationnels dans le TCR, présentent également une altération du développement des cellules γδT17 mais un développement normal des cellules γδT1 .

Syk est nécessaire pour la différenciation γδT17

Récemment, nous avons signalé un nouveau mécanisme de régulation par lequel les kinases γδTCR-proximales Syk et Zap70 contrôlent de manière différentielle l’induction γδT17 . Les souris déficientes en Syk présentent une perte complète de cellules γδT17 (à la fois les sous-ensembles Vγ4+ et Vγ6+) dans le thymus. Notamment, l’expression forcée de Zap70 dans les cellules progénitrices T déficientes en Syk n’a pas permis de restaurer la génération de cellules γδT17, suggérant un rôle non redondant de Syk dans la différenciation γδT17. Comme les cellules γδT déficientes en Syk, mais pas en Zap70, présentent une réduction significative de la phosphorylation d’Akt induite par la stimulation de γδTCR, il est indiqué que Syk est le médiateur de l’activation de la voie PI3K-Akt induite par γδTCR. Les souris déficientes en PI3K (p110γ-/- p110δ-/-) présentent une inhibition complète du développement des cellules γδT17, mais ne sont pas affectées en termes de sélection γδ (upregulation CD5) ou de développement γδT1. L’inhibition de PI3K réduit l’expression des facteurs de transcription associés aux γδT17 (Rorc, Sox13 et Sox4), suggérant un rôle crucial de la voie PI3K-Akt dans l’induction du programme de différenciation des γδT17. En accord avec cela, un rapport précédent a démontré que les souris PI3Kδ inactives ou PI3Kγ déficientes présentent une réduction marquée du nombre de cellules γδT17 périphériques et une amélioration de l’inflammation dépendante de γδT17. La voie PI3K-Akt est également requise pour la différenciation des cellules αβT (Th17) productrices d’IL-17 , ce qui suggère que cette voie de signalisation est un mécanisme de régulation commun partagé par les lignées αβT et γδT pour induire des sous-ensembles pro-inflammatoires producteurs d’IL-17.

γδTCR-induced activation de la voie PI3K-Akt dépend de Syk mais pas Lat, indiquant que Syk conduit la voie PI3K-Akt pour induire la différenciation γδT17 en plus de la voie de signalisation principale dépendante de Lat qui induit la sélection γδ . Il n’est pas clair si Syk active la voie PI3K/Akt dans les cellules γδT par interaction directe ou de manière indirecte. Une étude précédente a rapporté que les souris déficientes en Rasgrp1 présentent un phénotype effecteur de cellules γδT similaire à celui des souris déficientes en PI3K (c’est-à-dire une perte de cellules γδT17 et une augmentation de cellules γδT1) . Comme Rasgrp1 peut fonctionner comme un activateur en amont de la voie PI3K/Akt dans la signalisation αβTCR , il est probable que Rasgrp1 relaie les signaux de γδTCR à PI3K pour induire la différenciation γδT17.

La perte préférentielle de cellules γδT17 a également été signalée chez les souris déficientes pour Blk, une kinase de la famille Src exprimée dans les cellules γδT ainsi que dans les cellules B, bien que sa fonction dans la transduction du signal γδTCR soit inconnue .

Zap70 contrôle certains sous-ensembles de cellules γδT

Nous avons également démontré le rôle de Zap70 dans la différenciation thymique des cellules γδT . Les souris déficientes en Zap70 présentent une réduction marquée des cellules Vγ6+, dont la majorité sont des γδT17, mais ne sont pas affectées en termes de développement d’autres cellules γδT, y compris les sous-ensembles Vγ1+ ainsi que Vγ4+. En effet, le niveau d’expression de la protéine Zap70 était le plus élevé dans le sous-ensemble Vγ6+ parmi les cellules γδT. Comme l’expression de CD5 était plus faible dans les cellules Vγ6+ déficientes en Zap70 que dans les cellules témoins, Zap70 est probablement nécessaire à la maturation thymique des cellules Vγ6+. Dans nos expériences, les souris déficientes en Zap70 présentaient une différenciation thymique normale des cellules Vγ4+, y compris le sous-ensemble γδT17, ce qui contredit le rapport précédent dans lequel une mutation hypomorphe de Zap70 provoquait une réduction des cellules thymiques Vγ4+ γδT17 . Cette divergence peut être due aux différentes souris utilisées dans les deux études (le groupe de Hayday a utilisé des souris mutantes Zap70 hypomorphes sur un fond BALB/c, alors que nous avons utilisé des souris déficientes en Zap70 complet sur un fond C57BL/6). De plus, les souris déficientes en Zap70 présentaient une réduction significative des cellules Vγ4+ périphériques, qui comprenaient à la fois les sous-ensembles γδT17 et γδT1, mais ne présentaient aucune altération des cellules Vγ1+. Ainsi, contrairement à son rôle essentiel dans le développement des cellules αβT, l’exigence de Zap70 est limitée à la maturation thymique des cellules Vγ6+ et au maintien périphérique des cellules Vγ4+.

Nos résultats sur les différents rôles de Zap70 et Syk pourraient fournir un nouvel indice pour comprendre les mécanismes de la signalisation γδTCR et du développement des cellules γδT. Zap70 est nécessaire à la signalisation αβTCR et à la signalisation γδTCR dans certains sous-ensembles de cellules γδT. Dans les cellules αβT, l’activation de Zap70 dépend de Lck, qui est couplé aux corecepteurs CD4 ou CD8 qui se lient au pMHC à la surface des cellules présentatrices d’antigènes . Ainsi, il est suggéré que Lck-Zap70 est un axe de signalisation qui est spécialisé dans la reconnaissance des antigènes réalisée par le contact cellule-cellule ; bien que dans le cas des cellules γδT, la façon dont Zap70 est activé malgré l’absence d’expression de CD4 et CD8 reste obscure. En revanche, Syk est associée à un large éventail d’immunorécepteurs, notamment le pré-TCR, le γδTCR, le BCR et le FcR . Comme Syk est capable de phosphoryler les ITAM et les cibles en aval indépendamment des kinases de la famille Src telles que Lck , ces récepteurs peuvent être activés indépendamment du ligand ou lors de la liaison à une variété d’antigènes solubles ou de surface cellulaire. Ainsi, l’utilisation de Syk ou de Zap70 dans la signalisation des immunorécepteurs peut dicter la façon dont le récepteur reconnaît l’antigène. En effet, l’expression de Syk à la place de Zap70 a rendu les cellules αβT capables de répondre à la stimulation des anticorps anti-CD3 solubles, alors que les cellules αβT normales ne répondent qu’aux anticorps anti-CD3 multimérisés qui imitent l’interaction avec le pMHC de surface cellulaire. Ces résultats nous ont incités à émettre l’hypothèse que le mode de reconnaissance des antigènes utilisé par les lymphocytes pourrait être déterminé non seulement par leur récepteur en soi, mais aussi par l’utilisation distincte des kinases de la famille Syk. Sur la base de ce concept, nous prédisons qu’il existe des ligands γδTCR endogènes de surface cellulaire nécessaires à la maturation thymique des cellules Vγ6+, ainsi qu’au maintien périphérique des cellules Vγ4+, et que les cellules Vγ1+ ne nécessitent pas de ligands γδTCR de surface cellulaire pour leur développement et/ou leur maintien.

Processus indépendants et -dépendants de γδTCR pour l’induction de γδT17

Un rapport récent a élégamment démontré que les cellules γδT17 proviennent d’un progéniteur distinct des autres sous-ensembles de cellules γδT . Il a été signalé que des progéniteurs intrathymiques d’origine fœtale exprimant des niveaux élevés de Sox13 ont été identifiés dans une population précédemment classée comme thymocytes DN1d (CD44+CD25-c-kit-CD24hi). Ces progéniteurs Sox13+ ont préférentiellement donné naissance à des cellules γδT17 dans le thymus fœtal reconstitué, alors que d’autres progéniteurs au sein de la population DN2 ne l’ont pas fait. Plus important encore, les progéniteurs Sox13+ étaient détectables et leurs programmes de lignage γδT17 étaient intacts chez les souris déficientes en TCRδ ou en Rag, ce qui indique que le destin du lignage γδT17 est  » précâblé  » par un mécanisme cellulaire intrinsèque et indépendant du γδTCR. Un rapport précédent a toutefois montré que les cellules γδT17 peuvent se développer à partir du stade DN2 (CD44+CD25+c-kithi) lorsqu’elles sont cocultivées sur une monocouche de cellules stromales exprimant le ligand Notch . Il pourrait donc être nécessaire de redéfinir les étapes de différenciation et les relations progéniteur-descendant dans le développement des cellules γδT.

La figure 3 résume les processus de différenciation des cellules γδT ainsi que des cellules αβT, en soulignant les différences dans l’exigence des signaux αβ/γδTCR et des kinases de la famille Syk. Les premières étapes de la différenciation, c’est-à-dire la sélection β pour le lignage cellulaire αβT et la sélection γδ pour le lignage cellulaire γδT, sont dirigées par la signalisation pré-TCR ou γδTCR indépendante du ligand, qui sert de point de contrôle pour les cellules exprimant une chaîne TCRβ ou γδTCR fonctionnelle, respectivement. Ces signaux de récepteurs indépendants du ligand sont initiés par Syk, qui est exprimé dans les thymocytes DN, y compris les précurseurs γδT. Dans la lignée cellulaire γδT, le signal γδTCR médié par Syk est également nécessaire pour amorcer la différenciation des cellules γδT17 via l’activation de la voie PI3K. Pendant la sélection β et la sélection γδ, l’expression de Syk et de Zap70 est inversement régulée : Syk est régulée à la baisse tandis que Zap70 est régulée à la hausse lors de la signalisation pré-TCR ou γδTCR. Par conséquent, l’étape ultérieure de la différenciation de la lignée αβT dépend de la signalisation αβTCR médiée par Zap70, qui permet aux thymocytes DP de reconnaître le pMHC à la surface des TECs afin d’être sélectionnés positivement ou négativement en fonction de la force de l’interaction αβTCR-pMHC. En revanche, la signalisation γδTCR médiée par Zap70 en réponse à des ligands endogènes détermine la fonction effectrice des cellules γδT : un signal fort induit γδT1, tandis qu’un signal faible/absent induit γδT17.

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