Résultats et discussion

Les structures et les énergies de divers systèmes modèles mutés de KSI ont été étudiées le long de trois étapes réactionnelles : premièrement, abstraction du proton C4-β (ES → TS1 → EI1) ; deuxièmement, légère rotation de l’Asp-40 protoné (EI1 → TS2 → EI2) ; et troisièmement, don de proton à la position C6-β par l’Asp-40 (EI2 → TS3 → EP), comme le montre la Fig. 1. Le profil énergétique prédit de WT (Fig. 2A) est similaire au profil expérimental correspondant de Pollack et ses collègues (25). Il convient de noter qu’à TS2, le substrat est partiellement neutralisé, car les atomes H des résidus catalytiques se rapprochent de l’oxyanion (O3) du substrat et l’excès d’électrons est transféré du substrat aux résidus catalytiques adjacents par les voies de liaison H. Ainsi, le substrat, Tyr-16/57, et Asp-103 partagent une unité de charge négative, et leurs distributions de charge dépendent des affinités protoniques et des affinités électroniques des résidus catalytiques des mutants. Cet état TS2 avec résidus catalytiques est opposé à celui sans résidus catalytiques dans lequel le substrat est chargé négativement de presque une unité.

Nos structures tridimensionnelles calculées des EI (complexées avec l’équilénine au lieu du stéroïde) correspondent presque exactement aux structures radiographiques de PI(g′) et TI(g′). Dans la structure prédite du complexe Tyr-16/57 + Asp-103 + équilénine, les deux distances des valeurs d(O3-Or) pour Tyr-16 et Asp-103 (2,54 et 2,55 Å, respectivement) sont en bon accord avec les données des rayons X (2,6 ± 0,1 Å pour les deux dans le cas de PI et 2,58 ± 0,08 Å et 2,62 ± 0,07 Å, respectivement, dans le cas de TI) (32, 33, 36). Comme les structures calculées ont été optimisées sans contraintes, la correspondance entre les géométries expérimentales et théoriques indique que dans l’enzyme, les résidus clés ont des interactions presque maximales avec le substrat sans contrainte.

Il a été conjecturé qu’en solution, le site actif de TI peut avoir la structure dyadique (Asp-99… Tyr-14… équilénine) (29), qui est différente des structures radiographiques de TI et PI (32, 33). Cependant, une expérience récente de RMN pour PI/équilénine a indiqué que, dans PI(D40N)/équilénine, une forte résonance caractéristique en champ descendant apparaît à 16,8 ppm, et une faible à 13,1 ppm (36), similaire au cas de TI/équilénine par les groupes de Mildvan (29) et Pollack (25). Ce résultat est également démontré par nos calculs ab initio du complexe Tyr-16/57 + Asp-103 + équilénine, où la forte résonance en champ descendant à 16,5 ppm est attribuée à Tyr-16. L’expérience montre également que, dans le mutant D103L + D40N, une forte résonance en champ descendant (attribuée à Tyr-16) apparaît, tandis que dans le mutant Y16F + D40N, la forte résonance disparaît. Ainsi, cette expérience exclut clairement la structure dyadique dans laquelle la forte résonance de champ descendant a été attribuée à Asp-103, qui est lié par H à Tyr-16 (36).

Les constantes de vitesse absolues peuvent être étudiées en utilisant les barrières d’activation calculées. Aux niveaux B3LYP/6-31+G* et MP2/6-31+G*, la barrière d’activation de la WT du KSI est quelque peu sous-estimée, par rapport à la barrière expérimentale (10 à ≈11 kcal/mol) rapportée par Pollack et ses collègues (46). Cependant, lorsque l’effet du milieu diélectrique du KSI (31) est pris en compte, la barrière d’activation du WT est de 8,2 kcal/mol, en accord étroit avec la valeur expérimentale. Une légère sous-estimation de 2-3 kcal/mol pourrait s’expliquer par un calcul plus précis et un système modèle plus complet incluant des résidus apolaires autour du site actif. Contrairement à la barrière d’activation absolue, les barrières d’activation relatives entre les différents mutants et donc le mécanisme de réaction sont assez cohérents indépendamment du niveau de calcul en raison de l’effet d’annulation entre les différents systèmes modèles ayant des environnements similaires. Ainsi, en utilisant les barrières d’activation relatives entre différents mutants, nous avons obtenu la réactivité relative (le rapport de la constante de vitesse cinétique d’un mutant à celle du WT) ou log(kcat/kcat(WT)) en supposant que le transfert de ES à TS1 est l’étape déterminant la vitesse le long des chemins de réaction (voir la note de bas de page du tableau 1). Les calculs MP2 renforcent les résultats obtenus au niveau B3LYP. Les valeurs prédites de log(kcat/kcat(WT)) sont en bon accord avec les valeurs mesurées pour PI (32-35) et TI (25-28, 31) (Tableau 1). Étant donné que la structure tridimensionnelle (tertiaire et quaternaire) hautement homologue et l’environnement du site actif de TI sont similaires à ceux de PI, les réactions catalytiques dans les deux KSI devraient se dérouler de la même manière.

Fig. 2 montre les profils des énergies et des distances des liaisons H pour divers mutants le long du chemin de réaction. Les profils énergétiques globaux (ΔE) (Fig. 2A) sont presque symétriques par rapport à TS2. Les barrières de la première et de la troisième étape sont similaires. La deuxième étape, qui présente une petite barrière (≈1 kcal/mol), ne peut pas être déterminante pour le taux car elle n’implique qu’un léger déplacement de l’atome H par une rotation minimale (de quelques degrés seulement car l’Asp-40 est fortement incliné contre le plan du substrat) autour d’une liaison C-C (ou liaison C-H dans les figures 1 et 3). Ainsi, la réaction peut pratiquement être considérée comme un mécanisme en deux étapes. Les résidus catalysent la première étape en donnant (partiellement) un proton au substrat (comme un acide), tandis que la troisième étape est catalysée par l’acceptation (partielle) d’un proton du substrat (comme une base). Se référer aux distances interoxygènes des liaisons H et à la distance décentrée d’un proton partagé par rapport au point médian de O3 et Or où la valeur positive/négative indique que le proton est proche des résidus/substrat.

Pour les résidus acides avec une affinité protonique plus faible (pA dans la phase gazeuse ou pKa dans le milieu diélectrique), la barrière d’activation serait plus faible pour la première étape et plus élevée pour la troisième étape, alors que les résidus basiques avec un pA ou pKa plus élevé produiraient un effet contraire. Par conséquent, dans le mécanisme enzymatique à deux étapes, le pouvoir catalytique optimal est obtenu lorsque les résidus de l’enzyme jouent un double rôle de donneur/accepteur de protons très puissant vers/depuis le substrat alternativement (à nommer comme catalyseur amphi-acide/base ou tampon de protons/électrons) pour la réaction globale. Dans le milieu diélectrique des enzymes, l’effet catalytique maximal est obtenu dans le cas de pKas égaux des résidus et du substrat . Cette situation est à l’opposé des réactions en une seule étape où une grande différence de pKa augmente la réactivité (47, 48). La condition d’un pKa égal entre les résidus et le substrat pour l’effet catalytique maximal correspond à l’exigence des résidus dans l’enzyme de posséder un pKa équivalent avec le substrat pour former les SSHB maximales (4-7, 15, 23, 24). Ainsi, dans le mécanisme réactionnel en deux étapes du KSI, les SSHB en tant que catalyseurs amphi-acides/bases ainsi que les navettes partielles de protons et les redistributions de charges jouent un rôle crucial en stabilisant fortement les EI de ≈15 kcal/mol en énergie de stabilisation pilotée par les résidus et en raccourcissement de la distance interoxygène dépendant du chemin réactionnel par rapport à l’état ES .

L’énergie de stabilisation pilotée par les résidus ΔΔEa est dans une certaine mesure corrélée au ΔdES, à moins que le transfert de protons ne se produise du résidu vers le substrat (c’est-à-dire, à moins que le ΔrH soit dans une région négative dans la Fig. 2C). Par conséquent, la stabilisation aux EI et aux TS peut être corrélée au raccourcissement de la distance de liaison H, et donc de la force de la liaison H, par rapport à l’état ES. C’est-à-dire que les liaisons H normales (ou ordinaires) (entre partenaires neutres) à l’état ES tendent à devenir des liaisons SSHB (impliquant des espèces ioniques) aux EI et TS2. Ainsi, ces liaisons courtes devraient être responsables d’une partie de la baisse d’énergie induite par les résidus. Comme pour le transfert de protons, le potentiel à ES est un puits simple pour tous les mutants, alors que la forme du potentiel (près des EI ou des TS) dans la région où ΔrH est proche de zéro (c’est-à-dire autour de TS1/EI1 pour c et EI1/TS2 pour e et f dans la figure 2C) présente certaines caractéristiques d’un puits double. Pour une petite valeur absolue de ΔrH (<≈0,5 Å) (Fig. 2C), la barrière de transfert de protons s’avère être très faible dans notre calcul, et donc les transferts de protons dans le potentiel de type double puits ne peuvent pas expliquer à eux seuls l’abaissement drastique de la barrière d’activation. En effet, le cas g, dans lequel les caractéristiques de type double puits du potentiel disparaissent presque avec peu de transfert de protons, montre un abaissement d’énergie plus important que le cas f, qui implique un transfert de protons dans un potentiel de type double puits. D’autre part, il faut noter sur les Fig. 2 D et E que, après les transferts de protons, le ΔdES n’est plus raccourci mais légèrement allongé, alors que le ΔΔEa est toujours abaissé. Ainsi, le raccourcissement de la longueur de la liaison H (c’est-à-dire ΔdES) ne peut pas expliquer à lui seul l’abaissement drastique de la barrière au niveau des TS et des EI (c’est-à-dire ΔΔEa). Ainsi, l’abaissement de la barrière aux TSs et EIs doit être expliqué par des forces d’interaction supplémentaires, qui seront discutées en termes d’interactions d’orbitales moléculaires (MO) entre les substrats et les résidus (impliquant des réarrangements électroniques induits par le transfert de charge ou des redistributions de charge).

Dans le cas de deux résidus concurrents comme dans f et g, la stabilisation cumulative des EIs/TSs entraîne un kcat plus amélioré. Cependant, cet effet est quelque peu subadditif (c’est-à-dire plus petit que la somme des énergies de stabilisation de chaque résidu) en raison de la réduction du pouvoir de retrait des protons de l’oxyanion pour chaque résidu en raison de la présence de l’autre résidu. Cette sous-additivité indique que les SSHB impliqueraient des transferts de charge et une polarisation (c’est-à-dire des interactions électrostatiques induites) et éventuellement une liaison covalente partielle. En effet, la stabilisation des EI et des TS en présence de résidus catalytiques provient principalement de la délocalisation de l’électron en excès présent dans le site actif par transfert de charge et polarisation, ce qui sera vu ci-dessous. Les charges de population orbitales de liaison naturelle effectives (49) du substrat dans les cas a, c-e et f au TS1 sont respectivement de -0,57, ≈-0,43 et -0,37. Ainsi, la charge négative du substrat est plus réduite en présence de deux résidus catalytiques. Cette réduction provient du transfert de l’électron en excès du substrat vers les résidus catalytiques à grande affinité électronique, qui jouent le rôle de tampon pour l’électron en excès. Bien que Asp ait un pouvoir d’attraction des électrons plus fort que Tyr, Tyr a une affinité électronique plus faible que Asp. Ainsi, Tyr est aussi efficace, ou légèrement plus efficace, que Asp pour abaisser la barrière d’activation. La stabilisation des TS et EI en présence de résidus catalytiques est fortement corrélée à l’abaissement de l’énergie de l’état d’électron excédentaire, car l’espace pour accueillir l’électron excédentaire est élargi avec les résidus catalytiques en plus du substrat. Cet abaissement de l’énergie est directement lié au principe d’incertitude ; moins l’électron excédentaire est localisé, plus il est stabilisé.

Les déplacements chimiques calculés (δ) s’avèrent être quelque peu corrélés à la plus petite valeur de d(O3-Or) pour le même nombre de liaisons H , tandis que la présence d’une deuxième liaison H augmente δ en raison de l’effet d’écran renforcé. Sur la base de nos résultats, une grande valeur de δ peut souvent être un bon indicateur de SSHB, mais δ n’est que partiellement corrélé à kcat. Cette corrélation diminue particulièrement pour un grand δ (>16 ppm) ou une petite valeur absolue de ΔrH (<0,5 Å), la dépendance de kcat par rapport à δ ayant été remise en question (50).

L’abaissement des barrières d’activation en présence de résidus catalytiques est bien compris par l’analyse MO (Fig. 3). La distinction frappante des niveaux d’énergie de la MO TS2 entre a et g provient de la nature quantique de l’excès de densité électronique accumulé sur le substrat par déprotonation par Asp-40. La stabilisation obtenue en dissipant une partie de la densité électronique vers les résidus catalytiques est due au principe d’incertitude mentionné précédemment, qui est similaire à ce qui est observé dans le cas d’un électron en excès interagissant avec des clusters d’eau (51, 52), ce qui est en faveur d’un espace de cavité raisonnablement grand. Ainsi, la présence des résidus catalytiques (qui jouent le rôle de tampon de charge par transfert partiel d’électrons du substrat aux résidus catalytiques) réduit drastiquement l’accumulation de charge sur l’oxyanion. Cette stabilisation des EIs et des TSs est essentiellement assistée par les SSHBs. Cet effet est fortement renforcé en présence de l’Asp-103 et du Tyr-16/57. Les énergies de MO du cas g sont donc beaucoup plus faibles que celles du cas a. L’effet du milieu diélectrique de l’enzyme n’est pas aussi drastique que l’effet du résidu catalytique impliquant un transfert d’électrons. Ainsi, les navettes partielles de protons et les redistributions de charges favorisées par les SSHB sont plus responsables de l’abaissement des TS et EI que l’effet diélectrique de l’enzyme. Par conséquent, l’effet catalytique résulte d’une combinaison favorable de gains provenant des énergies électrostatiques non induites et des énergies d’interaction MO (polarisation, transfert de charge et énergie de liaison covalente). Alors que le premier résulte des navettes partielles de protons dues à la présence de liaisons H chargées (et donc liées à la force des SSHB), le second résulte principalement de la délocalisation électronique à cause des résidus catalytiques, qui jouent le rôle de tampon pour un électron en excès. Le gain d’énergie de l’interaction MO est étroitement lié à l’interaction supplémentaire enzyme-substrat favorisée par les SSHB.

L’énergie de stabilisation peut donc être représentée comme la somme de l’énergie accrue de la liaison H chargée (impliquant des espèces ioniques) des EI/TS par rapport à la liaison H normale (entre partenaires neutres) des ES et du gain d’énergie de l’interaction MO en raison des redistributions de charge impliquant la dissipation des électrons vers les résidus catalytiques. Comme les deux termes énergétiques ne sont pas facilement séparables, il est difficile d’estimer chaque terme. Cependant, nous évaluons ces termes dans le cas d en utilisant la méthode suivante. D’après la comparaison des énergies de EI1 par rapport à ES en l’absence et en présence de Tyr-16 (Y16), l’énergie de stabilisation de EI1 par Y16 est de 8,7 kcal/mol. Pour étudier la contribution de l’interaction électrostatique non induite (qui ne comprend pas l’effet d’induction électrostatique du substrat + Asp-40 (D40) sur le résidu Y16) à la stabilisation, nous avons effectué les calculs de l’ES et de l’EI1 dans le cas où Y16 est remplacé par un résidu fantôme composé uniquement de ses charges orbitales de liaison naturelle (NBO) (Y16q), qui ont été calculées pour une seule molécule Y16 en l’absence de substrat + D40. Ensuite, le gain d’énergie de l’interaction électrostatique non induite (ou gain d’énergie électrostatique induit par la préorganisation) est de 4,4 kcal/mol, ce qui est responsable de l’amélioration de la force de liaison de la liaison H chargée (c’est-à-dire la SSHB elle-même). Ensuite, la différence d’énergies de stabilisation entre l’effet quantique complet par Y16 et l’effet électrostatique non induit par Y16q (4,3 kcal/mol) devrait provenir de l’énergie d’interaction électrostatique induite, de l’énergie covalente, etc. L’interaction électrostatique induite comprend les effets de polarisation et de transfert de charge. Pour obtenir le gain d’énergie électrostatique induite, nous avons d’abord obtenu les charges atomiques de Y16 (Y16qind), qui incluent l’effet d’induction en présence du substrat + D40. Ensuite, nous avons effectué les calculs de l’ES et de l’EI1 dans le cas où Y16 est remplacé par un résidu fantôme (Y16qind) composé uniquement de ses charges atomiques ponctuelles. Cette énergie de stabilisation étant de 8,2 kcal/mol, le gain d’énergie électrostatique induit par l’interaction entre le substrat + D40 et Y16 est de 3,8 kcal/mol. Ainsi, le gain d’énergie par le transfert de charge et la polarisation est important et comparable au gain d’énergie électrostatique non induit. Le résidu Y16 joue des rôles catalytiques importants de tampon de charge pour retirer et garder une grande partie de la charge négative en excès dans le substrat ainsi que de la redistribution de la charge électronique correspondante pendant la réaction. Cette énergie électrostatique induite provient de l’énergie d’interaction MO par l’interaction mécanique quantique de charge électronique entre le résidu catalytique (Y16) et le substrat + D40 (c’est-à-dire l’énergie d’interaction substrat-résidu induite par la SSHB). Enfin, la contribution énergétique restante de 0,5 (= 8,7 – 8,2) kcal/mol pourrait correspondre principalement à l’énergie covalente non électrostatique. Cette énergie est plutôt faible, ce qui est en outre corroboré par notre analyse MO selon laquelle le chevauchement orbital non électrostatique dans la SSHB elle-même n’est pas significatif.

Dans les enzymes impliquant un mécanisme de réaction en deux étapes, un substrat n’est pas entièrement chargé négativement, mais est partiellement anionique avec une dissipation des électrons vers les résidus catalytiques. Ainsi, dans ce cas, l’incrément d’énergie de stabilisation (≈10 kcal/mol à EI1) entraîné par la SSHB par rapport à la liaison H normale s’avère ne pas être faible . Si l’énergie de SSHB est étendue pour inclure les interactions substrat-résidu dues aux redistributions de charge à la fois dans le substrat et le résidu, c’est l’énergie de stabilisation qui est la somme de l’énergie de SSHB pilotée par la préorganisation et de l’énergie d’interaction MO pilotée par SSHB. Cependant, si l’on ne considère que la force de la SSHB elle-même, l’incrément de l’énergie de liaison est beaucoup plus réduit (à ≈5 kcal/mol).