Méthodes d’essai pour la phototoxicité et les alternatives sur l’animal

Il est essentiel d’assurer la photosécurité des produits chimiques lorsqu’il y a des chances d’exposition humaine comme cela peut être clairement illustré par les produits pharmaceutiques (20) ou les cosmétiques (21). Pour évaluer le potentiel de phototoxicité d’un produit chimique, diverses méthodes d’essai ont été introduites, allant des essais in silico(22), in chemico(23), in vitro aux essais in vivo. Des tests in chemico comme la génération de ROS (24), des tests in vitro qui incluent le test 3T3 NRU et le modèle d’épiderme 3D, et des études in vivo employant des cobayes, des souris ou des rats pigmentés ont été développés et utilisés de façon routinière (25).

Source de lumière pour la phototoxicité. La source de lumière pour la phototoxicité est extrêmement importante puisque les longueurs d’onde absorbées par le produit chimique testé (spectre d’absorption) et la dose de lumière (réalisable dans un temps d’exposition raisonnable) doivent être suffisantes pour induire une phototoxicité (26). Les simulateurs solaires qui simulent la lumière naturelle du soleil sont considérés comme la source de lumière artificielle idéale (Fig. 5).

La distribution de la puissance d’irradiation du simulateur solaire filtré doit être proche de celle de la lumière du jour extérieure. Les simulateurs solaires sont équipés d’arcs au xénon ou d’arcs aux halogénures métalliques et au mercure (dopés). Ils doivent également être convenablement filtrés pour atténuer les longueurs d’onde UVB hautement cytotoxiques. Le spectre enregistré sous ces filtres ne doit pas s’écarter de la lumière du jour extérieure normalisée (spécification : FDA CFR Part 201.327, ISO 24444:2010(e), CIE-85-1989).

Néanmoins, d’autres sources de lumière UVA comme une lampe UVA peuvent également être utilisées avec un dosimètre UV approprié pour vérifier l’intensité et la longueur d’onde. L’intensité de la lumière (irradiance) varie en fonction des sources, et elle doit être régulièrement vérifiée avant chaque test de phototoxicité à l’aide d’un UV-mètre à large bande approprié. L’UV-mètre doit avoir été étalonné avant chaque mesure. En conséquence, le temps d’irradiation dépend de l’intensité de la source lumineuse (par exemple, pour une source lumineuse de 1,7 mW/cm2, un temps d’exposition de 50 min est nécessaire pour atteindre 5 J/cm2). Le temps d’irradiation varie également en fonction des méthodes d’essai. Une dose de 5 J/cm2 (mesurée dans la gamme UVA) a été déterminée comme étant non cytotoxique mais suffisamment puissante pour exciter les produits chimiques afin de provoquer des réactions phototoxiques dans le test d’absorption du rouge neutre 3T3.

T3T3 Essai d’absorption du rouge neutre. L’essai 3T3 NRU a été officiellement approuvé par l’OCDE et entériné en tant que OECD TG432 le 13 avril 2004 (3). Ce test évalue la photocytotoxicité en déterminant la réduction relative de la viabilité cellulaire après l’exposition à l’article testé en présence ou en l’absence d’irradiation UV/VIS. La décision d’effectuer le test de phototoxicité 3T3 NRU est prise pour les produits chimiques qui présentent des spectres d’absorption dans la région UV/VIS lorsqu’ils sont dissous dans un solvant approprié (17). Il a été suggéré que si le coefficient d’extinction/absorption molaire est inférieur à 10 litres x mol-1 x cm-1, il est peu probable que le produit chimique soit photoréactif (par exemple, dans une cuvette UV avec un trajet lumineux de 1 cm, la DO d’une solution 0,05 M doit être inférieure à 0,5 pour être considérée comme non photoréactive selon l’équation  » absorbance = coefficient d’extinction x longueur du trajet x concentration « ) (26). Le test 3T3 NRU présente une capacité prédictive très sensible mais peu spécifique (une sensibilité de 93 % et une spécificité de 84 %). Le test 3T3 NRU présente de nombreuses limites. Il ne peut pas prédire les effets indésirables autres que la photo(cyto)toxicité qui peuvent résulter de l’action combinée d’un produit chimique et de la lumière, comme la photogénotoxicité, la photoallergie (photosensibilisation) ou la photocarcinogénicité. Le test 3T3 NRU n’est utilisé que pour l’identification des dangers et son utilité pour l’évaluation de la puissance phototoxique n’est pas garantie. En particulier, ce système de test manque d’activité métabolique, qui est essentielle dans la manifestation des produits chimiques exposés de manière systémique. Par conséquent, pour les produits chimiques exposés de manière systémique qui nécessitent une activation métabolique comme la monocrotaline, la riddelliine et l’héliotrine (alcaloïdes de la pyrrolizidine) (28), des études in vivo sur des animaux sont recommandées (5,29).

Le principe de test fondamental du 3T3 NRU est la comparaison de la viabilité cellulaire en présence ou en l’absence d’irradiation UV/Vis, déterminée avec le colorant vital, le rouge neutre, qui est un colorant cationique faible qui pénètre facilement les membranes cellulaires et s’accumule de manière intracellulaire dans les lysosomes des cellules viables. La lignée cellulaire de base est la cellule Balb/c 3T3, qui est un fibroblaste de souris développé à partir d’embryons de souris par G.T. Todaro en 1968. La désignation 3T3 signifie « transfert de 3 jours, inoculum de 3 × 105 cellules » dans une boîte de 20 cm2, et cette cellule est relativement stable, facilement disponible et facile à manipuler (30). Le fibroblaste dermique est l’une des cellules cibles de la phototoxicité, ce qui fournit une justification solide pour l’emploi des cellules 3T3.

Pour décider si l’article testé est phototoxique ou non dans l’essai NRU 3T3, la concentration-réponse doit être obtenue en présence et en l’absence d’irradiation. Le facteur de photo-irritation (PIF) ou l’effet photo moyen (MPE) doit être calculé (31). Le PIF est le rapport entre la CI50 (concentration qui diminue la viabilité cellulaire de 50 %) des non-irradiés et des irradiés, comme le montre la figure 7.

Modèle de prédiction de la photocytotoxicité par le PIF (facteur de photo-irritation).

Lorsque la CI50 ne peut être obtenue, le MPE est calculé selon l’équation suivante

PIF < 2 ou un MPE < 0,1 prédit : « aucune phototoxicité ». Un PIF > 2 et < 5 ou un MPE > 0,1 et < 0,15 prédit : « phototoxicité probable » et un PIF > 5 ou un MPE > 0,15 prédit : « phototoxicité » (Fig. 8).

Calcul de l’effet photo : L’effet photo (PEC) à une concentration arbitraire C est défini comme le produit de l’effet de réponse (REC) et de l’effet de dose (DEC), c’est-à-dire PEC = REC × DEC. La définition est illustrée comme reprise de (31). Le calcul de l’effet photo à la concentration 0,4 suit les équations données dans le texte : effet de réponse RE0,4 = (66% – 11%)/100% = 0,55, effet de dose DE0,4 = (0,4/0,16 – 1)/(0,4/0,16 + 1) = 0,43, et effet photo PE0,4 = 0,24. L’effet photo moyen est obtenu en faisant la moyenne des valeurs de l’effet photo à différentes concentrations (31).

Test d’hémolyse des érythrocytes. Les membranes cellulaires sont vulnérables aux ROS et aux radicaux générés par voie photochimique. Les dommages induits par les UVA sur les érythrocytes et l’hémolyse qui en résulte (photohémolyse) sont utilisés pour évaluer le potentiel phototoxique des articles testés (32). Des globules rouges de mouton (SRBC) sont incubés avec des produits chimiques et irradiés avec des UVA à 20 J/cm2. Après irradiation, les CSRB sont incubés dans l’obscurité pendant 2 h à température ambiante, puis pendant 1 h supplémentaire à 37℃, après quoi l’hémolyse est mesurée à l’aide du réactif de Drabkin et de la mesure de l’absorbance UV à 540 nm. L’étendue de la phototoxicité a été évaluée par la libération de l’hémoglobine des CSRB, c’est-à-dire l’activité photohémolytique selon l’équation (33).

• ADE : densité optique de la solution de médicament exposée avec érythrocytes

• AD : densité optique de la solution de médicament exposée sans érythrocytes

• C : densité optique de la solution témoin hémolytique à 100%

Les phototoxicants comme la ciprofloxacine, la norfloxacine ou l’énoxacine augmentent significativement l’activité photohémolytique au-delà de 20% à 100 μg/mL. La sensibilité, la spécificité et la précision de ce test étaient respectivement de 67 %, 73 % et 73 % pour 24 produits chimiques (8 parfums, 5 absorbeurs d’UV, 4 médicaments, 4 antimicrobiens et 3 colorants) par rapport au test in vivo sur cobaye (34). La faible sensibilité peut être problématique et ses performances sont bien inférieures à celles du test 3T3 NRU, ce qui peut expliquer la diminution de l’utilisation de ce test récemment.

Modèle d’épiderme humain 3D in vitro. Pour surmonter les limites des méthodes in vitro à base de cellules, le modèle d’épiderme reconstruit en 3D est étudié pour l’application aux tests de phototoxicité (35,36). Le principe du test est similaire au test 3T3 NRU, à savoir l’évaluation de la différence de viabilité des tissus en présence et en l’absence d’irradiation UV/VIS. Un modèle de prédiction similaire utilisant le PIF et le MPE peut être utilisé (37). Dans le modèle d’épiderme 3D, cependant, les matériaux insolubles dans l’eau peuvent être testés et une certaine capacité métabolique est préservée dans les kératinocytes primaires de la couche épidermique, ce qui peut être appliqué aux substances toxiques nécessitant une activation métabolique (38). En outre, la mesure de la production de cytokines comme l’IL-1β (Interleukine-1β) (39), le test des comètes (40) et l’examen histologique sont possibles et peuvent être pris en compte dans l’évaluation ultérieure de la photoallergénicité et de la photocarcinogénicité.

Méthodes in vivo employant des cobayes, des souris ou des rats pigmentés. Les animaux de laboratoire tels que les souris et les cobayes sont employés pour simuler le scénario réel de la phototoxicité humaine. Les animaux sont exposés à des produits chimiques par voie topique ou systémique et irradiés avec une dose appropriée d’UVA (généralement 10 J/cm2 pour le test du cobaye, 20 J/cm2 pour le test de la souris (41)). Les scores d’érythème et d’œdème de 0 à 4 sont additionnés et le score maximum pendant 72 heures d’observation est calculé en moyenne par animal pour générer un indice d’irritation. L’indice de phototoxicité est obtenu par l’équation « Indice d’irritation du site irradié par les UVA – Indice d’irritation du site non irradié » (42). Un indice de phototoxicité supérieur à 0,6 indique un potentiel de phototoxicité. On peut également mesurer l’épaisseur de l’oreille pour estimer l’œdème dans les tests sur les souris. Ces tests in vivo reflètent bien le processus physiopathologique de la phototoxicité chez l’homme, mais les sacrifices d’animaux, les dépenses et le temps nécessaires à la réalisation du test posent de nombreux problèmes, en particulier à une époque où l’on est largement sensibilisé au bien-être et à l’éthique des animaux. Les tests de phototoxicité non basés sur les animaux gagnent en popularité de nos jours pour surmonter ces problèmes (43).

Méthodes in chemico pour l’évaluation de la phototoxicité. Les méthodes en tube à essai sans cellules, à savoir in chemico ont été explorées pour évaluer la phototoxicité. Les informations sur l’absorption de la lumière et la photostabilité de l’article testé ont été analysées pour prédire la phototoxicité (44). En utilisant la génération d’espèces réactives de l’oxygène pendant la photoexcitation et la photoréaction ultérieure, le potentiel phototoxique d’un produit chimique peut être évalué in chemico (12). L’oxygène singlet est détecté par le blanchiment à la p-nitrosodiméthylaniline (RNO) tandis que le test au bleu nitro-tétrazolium (réaction NBT-formazan) est employé pour déterminer la génération de peroxyde, comme illustré ci-dessous (24),

• Oxygène de squelette + imidazole

• → → imidazole oxydé

• + RNO

• → blanchiment RNO + produits

Le test de génération de peroxyde a présenté la sensibilité et la spécificité de 90% et 76.9% pour les cosmétiques et 100% et 75% pour les produits chimiques non cosmétiques. L’activité de rupture des brins d’ADN est un autre moyen d’évaluer la phototoxicité induite par les UV de différents types de produits chimiques ou de médicaments in chemico en quantifiant l’ADN circulaire ouvert ou fermé. Ce test ne nécessite pas non plus de cellules ou de tissus vivants, mais un plasmide. Le plasmide est dissous dans un tampon et mélangé aux articles à tester. Après que le mélange ait été irradié par des UV, les échantillons sont soumis à une électrophorèse. La quantité d’ADN cassé est analysée par une technologie basée sur la fluorescence. Le composé phototoxique induit par les UV entraîne l’ouverture des brins d’ADN et cela dépend de la concentration du médicament et de la dose d’irradiation UV (33). Ces tests ne nécessitent pas de cellules ou de tissus vivants qui peuvent ajouter à la variabilité des résultats. Cependant, ces méthodes ont des limites qui incluent le manque de capacité d’activation métabolique, l’inapplicabilité des matériaux insolubles dans l’eau (huiles, solides, gels, produits formulés), et l’incapacité de prédire la photogénotoxicité, la photoallergie (photosensibilisation) ou la photocarcinogénicité. Ce test est limité à l’identification des dangers, et non à l’évaluation de la puissance phototoxique.