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Utiliser NEBcutter
NEBcutter accepte une séquence d’entrée, qui peut être collée, récupérée à partir d’un fichier local ou extraite du NCBI en tant que fichier GenBank via son numéro d’accession. Diverses options sont disponibles pour sélectionner la taille des ORF à afficher et l’ensemble des enzymes de restriction à utiliser. Le programme calcule les positions de tous les sites d’enzymes de restriction en notant ceux qui pourraient potentiellement être bloqués par une méthylation chevauchante et trouve les ORF dans la séquence. Il affiche ensuite un schéma de la séquence, les longs ORF, en fonction des règles décrites dans les Méthodes et toutes les enzymes de restriction qui la coupent une seule fois. L’affichage initial montre également les enzymes qui peuvent être utilisées dans une digestion complète pour exciser chaque ORF qui est affiché. La figure 11 montre une digestion typique, dans ce cas une vue linéaire du plasmide pBR322. Si la séquence d’ADN originale est circulaire, les affichages linéaires et circulaires sont tous deux proposés. À partir de l’affichage initial, de nombreuses options permettent d’aller plus loin, notamment la digestion personnalisée avec les enzymes de votre choix et divers affichages de la digestion. Il est également possible, à partir des affichages linéaires, de zoomer sur une région sélectionnée de la séquence pour obtenir une vue plus détaillée. Une option permet de sélectionner une région particulière et d’afficher les enzymes qui coupent immédiatement à côté de cette région. Ceci est utile pour trouver les enzymes capables d’exciser la région souhaitée. Si le zoom conduit à une région de <60 nucléotides, la séquence réelle est affichée (Fig. (Fig.2),2), ainsi que toute traduction appropriée. Sur cet affichage, toutes les enzymes qui coupent la séquence sont montrées, toutes les bases qui font partie de la séquence de reconnaissance d’une enzyme de restriction sont mises en évidence et le déplacement de la souris sur un nom d’enzyme produira une boîte avec la séquence de reconnaissance notée et la séquence elle-même devient soulignée dans l’affichage.
L’affichage linéaire d’une digestion du plasmide pBR322. Notez que les deux ORF principaux sont flanqués de sites (MseI et PflMI ; BspHI et EarI) qui pourraient être utilisés pour les exciser de la séquence plasmidique complète. Dans cet affichage, seules les enzymes qui clivent la séquence une fois sont montrées. Les options pour une digestion et un affichage supplémentaires sont disponibles par le biais des boutons en bas de l’affichage.
Affichage zoomé d’une courte région de pBR322. Notez que les bases surlignées en rouge et en bleu font partie des sites de reconnaissance des enzymes de restriction. Les rouges sont non ambiguës, tandis que les bleues sont des bases dégénérées. Ainsi, BsiEI reconnaît la séquence CGRYCG. Les résidus extérieurs CG sont invariants, tandis que les bases intérieures sont dégénérées et, dans la séquence spécifique indiquée, sont GT. Les bases indiquées en noir ne font partie d’aucun site de reconnaissance des enzymes de restriction. Cet affichage peut être utile pour trouver des enzymes de restriction capables de distinguer les allèles SNP.
Sur n’importe quel affichage principal, le déplacement de la souris sur le nom d’une enzyme de restriction affichera sa séquence de reconnaissance et le numéro de base précis auquel elle clive. Si plus d’un site est présent pour l’enzyme, alors tous les autres sites sont soulignés. En cliquant sur le nom de l’enzyme, on obtient une page contenant un résumé d’informations sur l’enzyme, notamment sa sensibilité à la méthylation, les types d’extrémités produites, les isoschizomères disponibles et une liste d’autres enzymes pouvant produire des extrémités compatibles. Pour les enzymes NEB, des renseignements sur les conditions de digestion et un lien vers le site Web de NEB sont fournis.
Une caractéristique clé de NEBcutter est qu’il incorpore tout ce qui est enregistré dans REBASE au sujet de la sensibilité à la méthylation de n’importe laquelle des enzymes affichées lorsqu’elles chevauchent un site Dam (GATC), un site Dcm (CCWGG), un site CpG, un site EcoKI (AACN6GTGC) ou un site EcoBI (TGAN8TGCT). Lorsque des digests théoriques sont réalisés, les résultats comprennent une comparaison des effets de la méthylation mettant en évidence les bandes qui se déplacent (Fig. (Fig.33).
Digest théorique montrant les effets de la méthylation Dcm chevauchante sur les sites MscI (séquence de reconnaissance : TGGCCA) présents dans la séquence si le bactériophage lambda avait été cultivé dans une souche E.coli exprimant la méthyltransférase Dcm (séquence de reconnaissance : CCWGG). Les fragments qui sont affectés par la méthylation de Dcm sont indiqués en rouge. Le gel virtuel est basé sur l’interpolation d’une courbe spline cubique générée à partir de données expérimentales produites avec des fragments de taille connue.
Sur chaque page, des liens dynamiques sont fournis qui ramènent à la page principale, fournissent une aide à l’interprétation de l’affichage ou permettent aux utilisateurs de renvoyer des commentaires aux auteurs. L’interface a été conçue pour être aussi intuitive que possible et pour permettre un accès facile aux principales fonctions utiles aux chercheurs qui tentent de cliver leur ADN. La version actuelle de NEBcutter a traité plus de 400 000 séquences provenant des utilisateurs. Nous préparons actuellement un certain nombre d’améliorations à NEBcutter et la version 2.0 est prévue pour le 1er juillet.