Le dogme central de la biologie moléculaire est ADN→ARN→Protéine. Pour synthétiser une protéine particulière, l’ADN doit d’abord être transcrit en ARN messager (ARNm). L’ARNm peut ensuite être traduit au niveau du ribosome en chaînes polypeptidiques qui constituent la structure primaire des protéines. La plupart des protéines sont ensuite modifiées par toute une série de modifications post-traductionnelles, notamment le repliement des protéines, la formation de ponts disulfure, la glycosylation et l’acétylation, afin de créer des protéines fonctionnelles et stables. L’expression des protéines fait référence à la deuxième étape de ce processus : la synthèse des protéines à partir de l’ARNm et l’ajout de modifications post-traductionnelles

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Les chercheurs utilisent diverses techniques pour contrôler l’expression des protéines pour des applications expérimentales, biotechnologiques et médicales. Les chercheurs peuvent visualiser les protéines in vivo en les marquant avec des protéines fluorescentes pour étudier leur localisation ou purifier les protéines pour étudier leur structure, leurs interactions et leurs fonctions. Les protéines peuvent également être purifiées pour être utilisées dans la recherche en biologie moléculaire (par exemple, les polymérases et autres enzymes pourraient être purifiées et utilisées pour manipuler l’ADN), ou en médecine (par exemple, l’insuline).

Les protéines, contrairement à l’ADN qui peut être relativement facilement synthétisé, doivent être produites en utilisant des mélanges complexes dérivés de cellules ou en utilisant des cellules vivantes. Il existe plusieurs types de systèmes d’expression utilisés pour la production et la purification des protéines. Il s’agit notamment des systèmes d’expression des mammifères, des insectes, des bactéries, des plantes, des levures et des cellules libres.

Dans l’ensemble, la stratégie générale d’expression des protéines consiste à transfecter des cellules avec la matrice d’ADN de votre choix et à laisser ces cellules transcrire, traduire et modifier votre protéine d’intérêt. Les protéines modifiées peuvent ensuite être extraites des cellules lysées grâce à l’utilisation de marqueurs protéiques et séparées des contaminants à l’aide de diverses méthodes de purification. Décider du système d’expression à utiliser dépend de plusieurs facteurs :

1. La protéine que vous essayez d’exprimer
2. Combien de protéines vous avez besoin
3. Vos plans pour les applications en aval

Dans ce billet de blog, nous résumerons certains des systèmes d’expression les plus courants, y compris leurs avantages et les mises en garde à garder à l’esprit avant de choisir un système.

Systèmes d’expression mammaliens

Les cellules mammaliennes sont un système idéal pour l’expression de protéines mammaliennes qui nécessitent de multiples modifications post-traductionnelles pour une fonction protéique appropriée. La plupart des constructions d’ADN conçues pour l’expression mammalienne utilisent des promoteurs viraux (SV40, CMV et RSV) pour une expression robuste après transfection. Les systèmes mammaliens peuvent exprimer des protéines de manière transitoire ou par le biais de lignées cellulaires stables. Les deux méthodes produisent des rendements élevés en protéines si la transfection est réussie.

Certains systèmes mammaliens permettent également de contrôler le moment où une protéine est exprimée grâce à l’utilisation de promoteurs constitutifs et inductibles. Les promoteurs inductibles sont extrêmement utiles si un produit protéique souhaité est toxique pour les cellules à des concentrations élevées. Malgré leurs avantages, les systèmes d’expression mammaliens nécessitent des conditions de culture cellulaire exigeantes par rapport aux autres systèmes.

Systèmes d’expression d’insectes

Les cellules d’insectes peuvent également être utilisées pour produire des protéines eucaryotes complexes avec les modifications post-traductionnelles correctes. Il existe deux types de systèmes d’expression d’insectes ; les cellules d’insectes infectées par un baculovirus et les cellules d’insectes non lytiques.

Les systèmes d’expression à base de baculovirus sont très puissants pour l’expression de protéines recombinantes de haut niveau. Ces systèmes permettent une expression élevée de protéines très complexes et glycosylées qui ne peuvent pas être produites dans les cellules d’E. coli ou de levure. Le seul problème des systèmes à baculovirus est que la cellule hôte infectée finit par être lysée. La lyse cellulaire interrompt la production de protéines, mais il existe des systèmes d’expression de cellules d’insectes non lytiques (cellules sf9, Sf21, Hi-5) qui permettent une expression continue des gènes intégrés dans le génome de la cellule d’insecte. Ces deux types de systèmes d’expression d’insectes peuvent être mis à l’échelle pour la production de grandes quantités de protéines.

Certains inconvénients des systèmes d’expression des cellules d’insectes incluent que la production de virus peut être assez longue et que les cellules d’insectes nécessitent des conditions de culture exigeantes similaires aux systèmes d’expression des mammifères.

Systèmes d’expression bactériens

Lorsqu’on veut produire de grandes quantités de protéines rapidement et à moindre coût, une cellule hôte bactérienne est presque toujours la réponse. E. coli est certainement l’un des hôtes les plus populaires pour l’expression des protéines avec plusieurs souches spécialisées dans l’expression des protéines. L’expression des protéines dans les bactéries est assez simple : l’ADN codant pour votre protéine d’intérêt est inséré dans un vecteur d’expression plasmidique qui est ensuite transformé dans une cellule bactérienne. Les cellules transformées se propagent, sont induites à produire votre protéine d’intérêt, puis sont lysées. La protéine peut alors être purifiée à partir des débris cellulaires.

Il existe plusieurs vecteurs d’ADN populaires qui peuvent être utilisés pour produire de grandes quantités de protéines dans des cellules bactériennes : les vecteurs pET, pRSET, Gateway pDEST, et pBAD par exemple. L’expression des protéines à partir de chacun de ces vecteurs est contrôlée par un promoteur différent, ce qui entraîne des niveaux d’expression différents pour chaque vecteur ; une expression plus faible peut être nécessaire si votre protéine est toxique pour E. coli. De tous les vecteurs, pET, sous le contrôle du promoteur T7 lac et induit par le lactose, fournit le plus haut niveau d’expression de la protéine.

Malgré leur facilité d’utilisation, il est important de noter que les bactéries ne peuvent généralement pas produire de protéines mammaliennes multi-domaines fonctionnelles car les cellules bactériennes ne sont pas équipées pour ajouter les modifications post-traductionnelles appropriées. En outre, de nombreuses protéines produites par les bactéries deviennent insolubles, formant des corps d’inclusion qui sont difficiles à extraire sans réactifs agressifs et sans patience.

Systèmes d’expression végétale

Les plantes fournissent un moyen bon marché et de faible technicité d’expression de masse des protéines recombinantes. De nombreuses cellules provenant de divers types de plantes comme le maïs, le tabac, le riz, la canne à sucre et même les tubercules de pommes de terre ont été utilisées pour l’expression de protéines.

Les systèmes végétaux partagent beaucoup des mêmes caractéristiques et exigences de traitement que les systèmes d’expression des cellules de mammifères, y compris la majorité des modifications post-traductionnelles complexes. L’extraction et la purification de protéines recombinantes à partir de plantes peuvent cependant être coûteuses et longues car les tissus végétaux eux-mêmes sont biochimiquement complexes.

Pour contourner ces problèmes, les scientifiques ont tiré parti de la sécrétion naturelle de produits biochimiques et de protéines par les racines des plantes. Le marquage des protéines recombinantes avec un peptide végétal naturellement sécrété permet un accès plus facile et la purification d’une protéine désirée. Bien qu’il s’agisse d’une technologie plutôt naissante, les cellules végétales ont été utilisées pour exprimer une large gamme de protéines, y compris des anticorps et des produits pharmaceutiques, en particulier des interleukines.

Systèmes d’expression de la levure

La levure est un excellent système d’expression pour générer de grandes quantités de protéines eucaryotes recombinantes. Bien que de nombreuses espèces de levures puissent être utilisées pour l’expression de protéines, S. cerevisiae, est l’espèce la plus fiable et la plus fréquemment utilisée en raison de son utilisation comme organisme modèle en génétique et en biochimie.

Lorsqu’ils utilisent S. cerevisiae, les chercheurs placent souvent les protéines recombinantes sous le contrôle du promoteur inductible du galactose (GAL). D’autres promoteurs couramment utilisés comprennent les promoteurs PHO5 et CUP1 inductibles par le phosphate et le cuivre respectivement. Les cellules de levure sont cultivées dans des milieux bien définis et peuvent être facilement adaptées à la fermentation permettant une production stable et à grande échelle de protéines.

En général, les systèmes d’expression de la levure sont plus faciles et moins chers à travailler que les cellules de mammifères, et sont souvent capables de modifier des protéines complexes contrairement aux systèmes bactériens. Les cellules de levure ont cependant un taux de croissance plus lent que les cellules bactériennes et les conditions de croissance doivent souvent être optimisées. Les cellules de levure sont également connues pour hyperglycosyler les protéines, ce qui peut être un problème en fonction de votre protéine de choix.

Systèmes d’expression acellulaire

Dans les systèmes d’expression acellulaire, les protéines sont assemblées in vitro en utilisant des composants purifiés de la machinerie de transcription et de traduction. Ceux-ci comprennent les ribosomes, l’ARN polymérase, les ARNt, les ribonucléotides et les acides aminés. Les systèmes d’expression sans cellules sont idéaux pour l’assemblage rapide de plus d’une protéine en une seule réaction. Un avantage majeur de ces systèmes est leur capacité à assembler des protéines avec des acides aminés marqués ou modifiés qui sont utiles dans différentes applications en aval. Les systèmes d’expression sans cellules sont cependant coûteux et très difficiles à utiliser sur le plan technique.

Alyssa D. Cecchetelli est scientifique chez Addgene. Elle a obtenu son doctorat à l’université de Northeastern et s’intéresse particulièrement à la signalisation et à la communication cellulaire. Elle aime pouvoir aider la communauté scientifique à partager des plasmides.

Ressources supplémentaires

• Systèmes d’expression de protéines de Shermofisher
• Expression de protéines recombinantes dans Escherichia coli : avancées et défis
• Production de protéines recombinantes dans les exsudats de racines de plantes

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