Chez les humains, environ 5 à 8 litres d’air entrent et sortent du poumon par minute au repos. L’air peut varier en concentration d’oxygène et de CO2, peut transporter des allergènes, et confère différents degrés d’étirement mécanique des voies respiratoires et des surfaces d’échange gazeux. Ces signaux sont détectés, relayés et transformés en sorties physiologiques telles que le contrôle de la pression sanguine pulmonaire, les réponses immunitaires et le rythme respiratoire, mais le mécanisme n’est pas clair. Les cellules neuroendocrines pulmonaires (PNEC) sont présentes dans un large éventail d’organismes, des poissons aux mammifères (1). Dans le poumon des mammifères, les PNEC sont les seules cellules épithéliales innervées des voies respiratoires et représentent moins de 1 % de la population totale de cellules épithéliales pulmonaires (2). Bien que des preuves in vitro aient impliqué les PNEC dans la détection de l’oxygène, le tonus des muscles lisses bronchiques et vasculaires, et les réponses immunitaires (1, 3), ces rôles n’ont pas été démontrés in vivo. Une étude récente a montré que l’ablation génétique des PNEC chez l’adulte ne compromettait pas l’homéostasie ou la réparation des voies respiratoires, ce qui laisse planer le doute sur l’importance in vivo de ces cellules (4). Les pathologies des PNEC, en particulier l’augmentation du nombre de PNEC, ont été documentées dans un large éventail de maladies pulmonaires, notamment l’asthme, la dysplasie broncho-pulmonaire, la mucoviscidose, la bronchopneumopathie chronique obstructive, la hernie diaphragmatique congénitale, l’hyperplasie neuroendocrine du nourrisson, le syndrome de mort subite du nourrisson et l’hypertension pulmonaire (5-8). Dans chaque cas, on ne sait pas si l’augmentation des PNEC est la cause ou la conséquence des symptômes.

Dans le poumon de la souris, la plupart des PNEC résident dans des groupes de ~3 à 20 cellules appelés corps neuroépithéliaux (NEB) (3, 9). Les PNEC solitaires et groupés contiennent des vésicules centrales denses, remplies de neuropeptides bioactifs comme le peptide lié au gène de la calcitonine (CGRP) ou d’amines comme la sérotonine (1). Ces substances sont libérées en réponse à des stimuli, tels que des changements du niveau d’oxygène. Les neuropeptides et les amines ont été impliqués dans certains des mêmes processus que les PNEC (10-12), ce qui laisse penser qu’ils pourraient jouer un rôle de médiateur dans la fonction des PNEC. Cependant, un lien de causalité n’a pas été démontré in vivo.

Nous avons initié l’étude actuelle pour découvrir les mécanismes sous-jacents à la hernie diaphragmatique congénitale (CDH), une anomalie congénitale associée à un dysfonctionnement pulmonaire considérable, y compris une réponse immunitaire accrue et une hypertension pulmonaire (13). Dans un modèle génétique de la HDC chez la souris, nous avons mis en évidence un défaut de regroupement des PNEC. Ce défaut est suivi d’une séquence d’événements : une augmentation des neuropeptides du PNEC, une augmentation des infiltrats immunitaires et un remodelage de la structure pulmonaire. Ces résultats offrent une démonstration in vivo de la fonction des PNEC. Comme les changements dans le nombre de PNEC et les neuropeptides associés ont été documentés dans de nombreuses maladies pulmonaires, nos résultats ont de larges implications au-delà de l’HDC.

Chez les humains, les mutations dans les gènes des récepteurs du rond-point (ROBO) ont été associées à l’HDC (13, 14). Pour étudier les défauts pulmonaires associés à la CDH, nous avons inactivé Robo1 et Robo2 dans l’épithélium dérivé de l’endoderme, y compris le poumon, en utilisant Shhcre (ci-après Shhcre;Robo mutant) chez la souris (15, 16). Bien que ces mutants survivent, ils présentent une surface d’échange gazeux réduite dès le jour postnatal (P) 15 (Fig. 1, A et B, et fig. S1). Nous avons réalisé un microréseau suivi d’une réaction en chaîne par polymérase transcriptase inverse quantitative (qRT-PCR) à P7, avant la réduction de la surface d’échange gazeux. Quinze des 20 gènes les plus exprimés de manière différentielle ont été impliqués dans les réponses immunitaires, et tous sont significativement augmentés, y compris Ccl3, Cxcl2, Tnfa, et Saa3 (Fig. 1C). Conformément à cette signature, nous avons observé un nombre élevé de cellules immunitaires, notamment des neutrophiles, des éosinophiles, des macrophages et des cellules T (Fig. 1, D et E, et fig. S2). En outre, on observe une augmentation de la proportion de macrophages M2 et une diminution de la proportion de macrophages M1 (fig. S3). Ces résultats indiquent que les mutants Shhcre;Robo présentent une sensibilité immunitaire accrue, imitant une comorbidité commune de CDH (13).

Bien que Robo soit exprimé dans la région alvéolaire du mésenchyme pulmonaire (fig. S4), son expression dans l’épithélium est limitée à de rares cellules le long des voies respiratoires (fig. 1F). Le colabellisation avec l’anticorps CGRP a révélé que les cellules épithéliales exprimant Robo sont des PNECs (Fig. 1G). Pour confirmer que les gènes Robo sont nécessaires à la fonction des PNEC, nous avons inactivé Robo à l’aide de Ascl1creERT2 (17), un driver cre knock-in qui confère une activité spécifique aux PNEC dans l’épithélium pulmonaire (fig. S5). Nous avons constaté que les mutants Ascl1creERT2;Robo présentaient à la fois une simplification alvéolaire et une augmentation des macrophages, récapitulant les phénotypes Shhcre;Robo (fig. S6). Ces résultats démontrent que Robo est requis spécifiquement dans les PNEC pour limiter le nombre de cellules immunitaires et prévenir la simplification alvéolaire.

Au jour embryonnaire (E) 13,5, les PNEC nouvellement spécifiés étaient des cellules solitaires dans les poumons des témoins et des mutants Shhcre;Robo (Fig. 2, A et B). À E15,5, une majorité de PNEC s’était agrégée en NEB dans le témoin. Cependant, les PNEC n’étaient pas regroupées dans les mutants Shhcre;Robo (Fig. 2, C et D). Ce phénotype très pénétrant a persisté dans les poumons postnatals (Fig. 2, E et F, et fig. S7). Le nombre total de cellules PNEC ne semble pas affecté, comme le confirme l’expression normale d’Ascl1 et d’autres marqueurs PNEC (fig. S8). Les cellules non regroupées du mutant perdent leur forme en coin et sont plus arrondies (fig. S7 et S9). En outre, contrairement aux contrôles, où les PNEC solitaires ne sont pas innervées (9), ~33,3% (31 des 93 cellules) des PNEC non regroupées sont innervées chez le mutant (Fig. 2F et fig. S9), ce qui suggère que l’innervation des PNEC ne dépend pas de la formation de grappes ou de la fonction Robo dans les PNEC.

Les mutants Ascl1creERT2;Robo présentent également un désassemblage des PNEC (fig. S10). Ce phénotype s’est manifesté même lorsque l’inactivation de Robo a été induite postnatalement, ce qui est postérieur à la formation des PNEC. Ensemble, nos résultats établissent que Robo est nécessaire à l’assemblage et au maintien des PNEC dans les NEB.

Robo peut fonctionner de manière dépendante ou indépendante de son ligand, Slit (18). L’analyse des mutants Slit montre que, alors que l’assemblage des PNEC n’est affecté chez aucun des mutants simples, il est réduit chez les mutants Slit1;3 (fig. S11, A à D). Ce résultat suggère que la fonction de Robo dans ce processus est probablement dépendante du ligand.

Slit et Robo fonctionnent principalement pour médier la répulsion cellulaire et rarement l’attraction (19). Pour déterminer si Slit agit comme un signal répulsif ou attractif pour les PNECs exprimant Robo, nous avons d’abord déterminé où les gènes Slit sont exprimés. Le rapporteur combiné Slit1;2-GFP (protéine fluorescente verte) a révélé une expression dans seulement environ 1 à 3 PNEC au sein de grands NEB, ce qui soulève la possibilité que les cellules exprimant Slit1/2 soient les cellules nucléantes de l’amas (fig. S11E). Ceci indique également une sous-spécialisation des PNEC au sein d’un cluster. L’expression de Slit3 est limitée à la couche de cellules musculaires lisses vasculaires entourant les artères, qui longe les bronches principales où se trouvent la plupart des PNEC (fig. S11, F et G). Ensemble, la proximité des cellules exprimant Slit et des PNEC exprimant Robo a soulevé la possibilité que les ligands de Slit puissent fournir un signal attractif pour les PNEC.

Pour tester cela, des PNEC GAD1-GFP+ triés par cytométrie en flux ont été ensemencés dans la chambre supérieure d’un insert de culture de migration cellulaire Boyden. Lorsque la protéine Slit a été ajoutée aux cellules de la chambre supérieure, ~52% moins de PNEC (P = 8,5 × 10-4) ont migré vers la chambre inférieure (fig. S12, J à I). Inversement, lorsque la protéine Slit a été ajoutée à la chambre inférieure, 18 % de PNEC supplémentaires (P = 7,5 × 10-5) ont migré vers le fond (fig. S11, L à N). Ces résultats suggèrent que Slit-Robo conduisent le regroupement des PNECs dans les NEBs, probablement par attraction cellulaire.

Pour tester un lien possible entre les PNECs et la réponse immunitaire, nous avons testé l’expression des neuropeptides produits par les PNECs (1). Sur les neuf gènes de neuropeptides testés, cinq étaient significativement régulés à la hausse chez les mutants Shhcre;Robo (Fig. 3A). La coloration avec un anticorps contre le CGRP a révélé que, bien que son expression demeure dans les PNECs du mutant, l’intensité de la coloration est augmentée et elle n’est plus limitée au côté basal de ces cellules (figs. S7 et S9). Nous notons également que, alors que le désassemblage s’est produit vers E15,5, l’augmentation des neuropeptides n’est observée qu’après la naissance, vraisemblablement lors de l’exposition à l’air (fig. S12).

Pour déterminer si l’augmentation des neuropeptides contribue à la réponse immunitaire, nous nous sommes concentrés sur le CGRP car son transcrit montre la plus grande augmentation parmi tous les tests (fig. 3A). Nous avons contré cette augmentation en reproduisant un allèle mutant de Cgrp dans le fond Shhcre;Robo (20). Chez les témoins Robo, la perte de Cgrp n’a pas modifié le nombre de macrophages (Fig. 3, B, D et F). Cependant, chez les mutants Shhcre;Robo, la perte de Cgrp a significativement diminué le nombre de macrophages de manière dose-dépendante (Fig. 3, C, E, et F). Nous avons également constaté que la perte de Cgrp inversait partiellement le phénotype de simplification alvéolaire (fig. S13). Nous notons que ni l’augmentation des macrophages ni la simplification alvéolaire n’ont été entièrement empêchées, ce qui suggère que l’augmentation d’autres neuropeptides peut s’ajouter aux résultats en aval. Comme l’alvéologénèse normale commence à P4 (21), l’apparition tardive de la simplification alvéolaire à P15 suggère que la perturbation de l’alvéologénèse n’est peut-être pas la cause principale. Bien qu’aucun changement dans la mort cellulaire n’ait été observé à P10, il y avait une nette réduction de l’élastine (fig. S14), qui est un déclencheur possible de la simplification (22). Les cellules immunitaires telles que les macrophages expriment des métalloprotéinases matricielles qui dégradent l’élastine (23). En outre, l’augmentation des macrophages est observée avant la simplification (figs. S1 et S2), ce qui soulève la possibilité d’une relation causale. Pour tester cette hypothèse, nous avons traité les poumons de Shhcre;Robo et de témoins avec du clodronate, un médicament hydrophile qui épuise les macrophages (24). Le traitement commençant à P5, avant l’augmentation du nombre de cellules immunitaires, a effectivement réduit le nombre de macrophages alvéolaires au niveau de base chez les mutants Shhcre;Robo (Fig. 4, A à E). Cela a atténué la diminution de l’élastine et a entièrement empêché la simplification (Fig. 4, F à J, et fig. S15). Ensemble, ces données offrent une démonstration in vivo que l’augmentation des infiltrats immunitaires est responsable de la simplification alvéolaire et que les deux sont des conséquences en aval du dysfonctionnement du PNEC.

Dans cette étude, nous présentons des preuves génétiques in vivo démontrant que les PNEC, malgré leur rareté, ont un impact profond sur la fonction pulmonaire postnatale. Bien que le défaut de PNEC soit déjà évident à E15.5 chez le mutant Shhcre;Robo, les résultats physiologiques, à commencer par la régulation positive des neuropeptides, commencent après la naissance. Cela suggère que l’effet du PNEC dépend de l’exposition des poumons à l’air. Ainsi, nos résultats délimitent un mode de transduction du signal dans lequel les PNEC sont des rhéostats sensibles sur la paroi des voies respiratoires qui traduisent les signaux environnementaux de manière non cellulaire-autonome en réponses immunitaires.

Nos résultats établissent Robo1,2 comme un ensemble de gènes qui contrôlent le regroupement des PNEC en NEB. Ils présentent également Slit et Robo comme des acteurs du tri sélectif des cellules dans l’épithélium d’un organe de mammifère. L’inactivation de Robo après la formation des NEBs a également conduit à un désassemblage, suggérant que les clusters sont activement maintenus. Bien que Slit-Robo soient largement connus pour leur rôle de médiateur de la répulsion cellulaire, nos données indiquent qu’ils conduisent le regroupement des PNEC par attraction cellulaire. L’inactivation de Robo a entraîné une altération de l’innervation et une perte de la localisation basale des neuropeptides. Ces changements peuvent sous-tendre l’impact en aval altéré des PNEC.

Une augmentation du nombre de PNEC a été documentée dans un large éventail de maladies associées aux poumons, allant de troubles rares comme le CDH à des conditions communes comme l’asthme (5-8). Nous notons que le phénotype du PNEC mutant de Robo est distinct de l’augmentation du nombre de PNEC. Cependant, les deux sont associés à une augmentation des neuropeptides, dont nous montrons qu’ils sont des effecteurs puissants de la fonction des PNEC. Nos résultats prédisent ainsi que plutôt que d’être une lecture passive de la maladie, les pathologies documentées du PNEC et les augmentations de neuropeptides peuvent servir de contributeurs actifs aux symptômes dans un large éventail de maladies respiratoires.