ABSTRACT

Avant la ligature, chaque fragment d’Okazaki synthétisé sur le brin traînant chez les eucaryotes doit être traité par nucléolyse. Le clivage par les nucléases a lieu dans le contexte des structures de rabat 5′ générées par la synthèse par déplacement de brin par l’ADN polymérase delta. Au moins trois ADN nucléases : Rad27 (Fen1), Dna2 et Exo1, ont été impliquées dans le traitement des volets du fragment d’Okazaki. Cependant, ni les contributions des nucléases individuelles à la synthèse des brins traînants ni la structure des intermédiaires d’ADN formés en leur absence n’ont été clairement définies in vivo. En appauvrissant conditionnellement les nucléases des brins traînants et en analysant directement les fragments d’Okazaki synthétisés in vivo dans S. cerevisiae, nous effectuons une évaluation systématique de l’impact de Rad27, Dna2 et Exo1 sur la synthèse des brins traînants. Nous constatons que Rad27 traite la majorité des lambeaux de lagging-strand, avec une contribution supplémentaire significative d’Exo1 mais pas de Dna2. Lorsque le clivage par nucléase est altéré, nous observons une réduction de la synthèse par déplacement de brin, par opposition à la génération généralisée de longs lambeaux 5′ de fragments d’Okazaki, comme le prédisent certains modèles. De plus, en utilisant des constructions restreintes au cycle cellulaire, nous démontrons que le traitement nucléolytique et la ligature des fragments d’Okazaki peuvent être découplés de la réplication de l’ADN et retardés jusqu’à ce que la synthèse de la majorité du génome soit terminée.