Isozyme de type I

Comme il est évident dans la Fig. 1,l’hexokinase sert de passerelle par laquelle le Glc entre dans les voies métaboliques alternatives. Néanmoins, il est probablement sûr de dire que l’hexokinase est plus communément considérée comme une enzyme glycolytique, et le métabolisme glycolytique est généralement considéré comme un processus cytoplasmique. Il était donc remarquable que, contrairement à d’autres enzymes glycolytiques, l’activité hexokinase (maintenant connue comme l’isoenzyme de type I) soit trouvée principalement dans les « fractions particulaires » des homogénats du cerveau (Crane et Sols, 1953). Des travaux ultérieurs (Johnson, 1960 ; Rose et Warms, 1967 ; voir aussi Wilson, 1995) ont démontré que l’hexokinase particulaire était associée aux mitochondries, et plus spécifiquement à la membrane mitochondriale externe (Rose et Warms, 1967 ; Kropp et Wilson, 1970). La liaison dépend essentiellement d’une séquence hydrophobe N-terminale (Polakis et Wilson, 1985) qui cible sélectivement l’isozyme de Type I vers les mitochondries (Gelb et al, 1992 ; Sui et Wilson, 1997) et est insérée dans le noyau hydrophobe de la membrane mitochondriale externe au cours de la liaison (Xie et Wilson, 1988). La Porine (également appelée `VDAC’, acronyme de `voltagedependent anion channel’) forme le canal par lequel les métabolites traversent la membrane mitochondriale externe, et a été identifiée comme la protéine de la membrane externe de la mitochondrie qui interagit avec l’hexokinase (Felgner et al., 1979 ; Lindén et al., 1982 ; Fiek et al., 1982). De plus, il y a des preuves qui soutiennent l’idée que la liaison de l’hexokinase se produit préférentiellement à la porine qui est située dans les sites de contact, régions dans lesquelles il y a un contact intime entre les membranes mitochondriales interne et externe (Dorbani et al., 1987 ; Kottke et al, 1988;BeltrandelRio et Wilson,1992a).

Les études classiques de Johnson(1960) et de Rose et Warms(1967) ont été rapidement suivies par des rapports d’hexokinase liée aux mitochondries provenant d’autres tissus normaux, en plus du cerveau, ainsi que de diverses cellules tumorales (pour les références, voir Wilson, 1985,1995). La signification physiologique potentielle de cette association d’une enzyme « glycolytique » avec les mitochondries, le site primaire du métabolisme oxydatif, a fait l’objet de nombreuses spéculations. Dès le début, et particulièrement après avoir reconnu que la protéine de liaison de l’hexokinase de la membrane mitochondriale externe était identique à la porine, et donc que l’hexokinase pouvait être positionnée près du point où l’ATP sortait de la mitochondrie (et l’ADP y rentrait), Les spéculations se sont largement concentrées sur la possibilité que cette proximité puisse favoriser une interaction métabolique intime entre la phosphorylation oxydative intramitochondriale comme source d’ATP substrat et la phosphorylation du Glc par l’hexokinase liée à la mitochondrie. Cette hypothèse avait, en fait, été envisagée par Rose et Warms (1967), mais n’a pas pu être étayée par leurs résultats expérimentaux. Cependant, le travail ultérieur par d’autres (encore une fois, pour les références, voir Wilson, 1985, 1995), en utilisant l’hexokinase liée à la mitochondrie de diverses sources, a produit des preuves à l’appui de l’idée que l’hexokinase liée à la mitochondrie avait un accès « préférentiel » ou « privilégié » à l’ATP généré intramitochondrial.

Les travaux menés dans notre laboratoire ont fourni une base solide pour l’opinion selon laquelle l’hexokinase liée aux mitochondries cérébrales à phosphorylation active est en effet étroitement couplée à un compartiment intramitochondrial du substrat ATP, généré par la phosphorylation oxydative. Le support expérimental de cette conclusion a été décrit dans une série de publications (BeltrandelRio et Wilson, 1991, 1992a,b ; de Cerqueira Cesar et Wilson, 1995, 1998, 2002 ; Hashimoto et Wilson, 2000). Une revue complète de ce travail n’est pas possible dans les contraintes du contexte actuel, mais nous soulignerons certains des principaux résultats pour illustrer la variété des approches expérimentales, toutes menant à la même conclusion, qui ont été utilisées dans ces études.

Les études initiales (BeltrandelRio et Wilson,1991,1992a,b) ont été réalisées à l’aide de méthodes spectrophotométriques dans lesquelles la production d’ATP par divers processus intramitochondriaux (phosphorylation oxydative, réaction de l’adénylate kinase, réaction de la créatine kinase) et la phosphorylation du Glc par l’hexokinase ont été liées à la production de NADPH, contrôlée à 340 nm, par l’utilisation d’enzymes de couplage appropriées. L’idée de base était qu’en comparant le taux de phosphorylation du Glc avec le taux de production d’ATP provenant de diverses sources, on pourrait déduire l’importance relative de divers processus intramitochondriaux générateurs d’ATP comme source d’ATP de substrat pour l’hexokinase. Et la conclusion était que, lorsque la phosphorylation oxydative se produisait, ni l’adénylate kinase ni la créatine kinase n’étaient une source significative d’ATP de substrat. De plus, seule une fraction de l’ATP produite par la phosphorylation oxydative était utilisée par l’hexokinase, avec pour résultat que dans le milieu extramitochondrial continuait d’augmenter à mesure que la phosphorylation oxydative se poursuivait. Le taux de phosphorylation de Glc n’a pas augmenté régulièrement en réponse à l’augmentation continue de l’ATP extramitochondrial, cependant, malgré le fait que ce dernier était comparable au Km pour l’ATP vu avec l’ATP extramitochondrial ajouté en l’absence de la phosphorylation oxydative, c’est-à-dire l’hexokinase n’aurait pas été « saturé » avec l’ATP extramitochondrial comme substrat (Fig.2). Cela suggère fortement que ce n’était pas l’ATP extramitochondriale qui était utilisée comme substrat.

Des résultats tels que ceux présentés à la figure 3 confirment cette hypothèse. Ici, la Glcphosphorylation a été suivie après l’initiation de la phosphorylation oxydative par l’ajout d’ADP, avec des concentrations croissantes d’ATP extramitochondrial présentes dès le début. Comme prévu par la cinétique classique de Michaelis-Menten, le taux initial de phosphorylation de Glc a augmenté avec l’augmentation de l’AT extra-mitochondrial. Cependant, avec le temps, un taux stable de phosphorylation de Glc a été atteint qui était indépendant de la quantité d’ATP extra-mitochondriale résiduelle présente. Ces résultats ont été interprétés comme indiquant que, alors que l’hexokinase liée aux mitochondries utilisait initialement l’ATP extramitochondriale, l’initiation de la phosphorylation oxydative a conduit à un changement dans la préférence du substrat, l’hexokinase devenant dépendante d’un compartiment intramitochondrial d’ATP dans lequel était déterminé par le taux de phosphorylation oxydative et indépendant de l’extramitochondrial.

Bien que la production d’ATP ait commencé presque immédiatement après l’initiation de la phosphorylation oxydative par l’addition d’ADP, il y avait un retard marqué dans l’initiation de la phosphorylation du Glc par l’hexokinase liée à la mitochondrie (Fig. 3D) avant l’atteinte d’un taux d’équilibre qui a persisté pendant une période prolongée. Cette période de latence initiale a été interprétée comme le temps nécessaire pour remplir un compartiment intramitochondrial avec l’ATP généré par la phosphorylation oxydative et dans lequel l’hexokinase liée aux mitochondries a puisé son substrat ATP. L’inhibition du transport d’électrons par l’ajout de KCN a entraîné une libération apparente d’ATP, vraisemblablement à partir du compartiment intramitochondrial, et les propriétés de ce « compartiment » (cinétique de remplissage, lien avec la production d’ATP intramitochondriale, etc.Malheureusement, la concordance avec les attentes n’est pas un guide infaillible de la vérité, et la « libération apparente d’ATP » s’est avérée par la suite être un artefact (Laterveer et al., 1993), dont la source est toujours inconnue.), dont la source n’est toujours pas comprise et qui n’a pas pu être reproduit dans des travaux ultérieurs (deCerqueira Cesar et Wilson, 1998). Malgré cet échec décourageant et embarrassant, le concept de base du couplage de l’hexokinase liée à la mitochondrie à un compartiment intramitochondrial d’ATP a été soutenu par d’autres preuves et a résisté aux tests expérimentaux ultérieurs.

Une méthode de double marquage isotopique a été développée comme alternative aux procédures spectrophotométriques (deCerqueira Cesar et Wilson, 1995). Le Glc marqué au 14C a été utilisé comme substrat pour l’hexokinase, et le 32Pi a fourni un substrat pour la synthèse d’ATP par phosphorylation oxydative. Le rapport32P/14C dans le Glc-6-P a donc fourni une mesure de l’activité spécifique du substrat ATP utilisé par l’hexokinase. Le rapport32P/14C du Glc-6-P produit par l’hexokinase liée aux mitochondries a été comparé à celui produit par l’hexokinase de levure, qui ne se lie pas aux mitochondries et utilise donc nécessairement l’ATP extramitochondrial comme substrat. Les cinétiques de marquage des pools d’ATP utilisés comme substrat par les hexokinases liées aux mitochondries et les hexokinases de levure étaient remarquablement différentes, ce qui est à nouveau cohérent avec l’idée que l’hexokinase liée aux mitochondries n’utilisait pas l’ATP extramitochondrial comme substrat, mais puisait plutôt dans un compartiment intramitochondrial d’ATP fourni par la phosphorylation oxydative.Par exemple (Fig. 4), l’addition d’un excès de 31Pi, diminuant ainsi de façon marquée la spécificité du 32P-ATP synthétisé par la phosphorylation oxydative, a entraîné une diminution rapide du rapport 32P/14C du Glc-6-P produit par l’hexokinase de levure, utilisant l’ATP extramitochondrial. En revanche, il y a eu un décalage et, par la suite, une diminution un peu plus lente du rapport 32P/14C du Glc-6-P produit par l’hexokinase liée à la mitochondrie. Ces dernières observations étaient à nouveau cohérentes avec l’idée que l’hexokinase mitochondriale utilisait un compartiment intramitochondrial d’ATP qui n’était pas librement équilibré avec l’ATP extramitochondriale.

Une autre approche expérimentale encore était basée sur une comparaison entre l’hexokinase liée à la mitochondrie et l’enzyme de levure non liée (de CerqueiraCesar et Wilson, 1998,2002). La logique sous-jacente est illustrée à la figure 5. Une quantité fixe de mitochondries de cerveau, avec de l’hexokinase liée, est mélangée avec des quantités croissantes de mitochondries de foie de rat, qui ne contiennent pas d’hexokinase liée. Les mitochondries cérébrales et hépatiques phosphorylent activement et le taux de production d’ATP dans le système augmente au fur et à mesure que la quantité de mitochondries hépatiques augmente. À dessein, la concentration d’ATP extramitochondriale est maintenue à une sous-saturation, c’est-à-dire à ÅKm d’hexokinase avec l’ATP extramitochondriale comme substrat (en l’absence de phosphorylation oxydative). Si l’hexokinase liée aux mitochondries utilise l’ATP extramitochondriale comme substrat, on s’attend à une augmentation progressive du taux de Glcphosphorylation lorsque le taux de production d’ATP est augmenté par l’ajout de quantités croissantes de mitochondries hépatiques. En fait, ce n’est pas ce qui est observé ; plutôt, le taux de phosphorylation de Glc par l’hexokinase liée aux mitochondries n’est pas significativement affecté par l’augmentation du taux de production d’ATP (Fig.6). En revanche, l’augmentation attendue du taux de phosphorylation de Glc est observée si l’hexokinase mitochondriale est remplacée par une quantité équivalente d’hexokinase de levure. Ces résultats sont donc à nouveau cohérents avec l’idée que l’hexokinase liée aux mitochondries utilise de l’ATP intramitochondrial, intrinsèque aux mitochondries auxquelles l’hexokinase est associée mais indépendant de toute augmentation de l’ATP extramitochondrial émanant des livermitochondries sans hexokinase.

Enfin, une autre preuve de l’opinion selon laquelle l’hexokinase liée à la mitochondrie peut distinguer l’ATP intra et extramitochondriale vient de l’examen de l’inhibition par l’analogue du Glc-6-P, le 1,5-anhydroglucitol-6-P (1,5-AnG6P). En l’absence de phosphorylation oxydative et avec l’ATPxtramitochondrial comme substrat, le 1,5-AnG6P est un inhibiteur assez puissant, compétitif par rapport à l’ATP (Fig.7) (Hashimoto et Wilson, 2000). En revanche, avec l’ATP fournie par la phosphorylation oxydative, le 1,5-AnG6P est beaucoup moins efficace comme inhibiteur. Il est clair que l’ATP fournie par la phosphorylation oxydative n’est pas équivalente à l’ATP extra-mitochondriale. Des résultats similaires ont récemment été rapportés en utilisant l’hexokinase themitochondriale du cerveau bovin(de Cerqueira et Wilson,2002).

En bref, le point de vue actuel est que, en l’absence de phosphorylation oxydative, l’hexokinase mitochondriale peut facilement utiliser l’ATP extramitochondriale, suivant la cinétique classique de Michaelis-Menten. Pendant la phosphorylation oxydative active, cependant, l’enzyme liée à la mitochondrie est couplée à un pool intramitochondrial d’ATP, avec le taux de Glcphosphorylation étroitement corrélé avec le taux de phosphorylation oxydative.Il semble difficile de croire que, dans les tissus normaux, les mitochondries soient jamais dans un état de non-phosphorylation totale. Des variations du taux ? Oui, bien sûr, en fonction des fluctuations de la demande énergétique. Mais une absence totale de phosphorylation ? Probablement seulement dans les circonstances les plus graves – et finalement mortelles. Il s’ensuit donc que, dans des conditions normales, le taux de Glcphosphorylation est étroitement coordonné avec les étapes oxydatives terminales du métabolisme de Glcm se produisant dans les mitochondries, avec la production associée d’ATP par phosphorylation oxydative. Comme on l’a déjà noté (Beltrandel-Rio et Wilson, 1992a), une telle coordination peut assurer l’introduction de Glc dans le métabolisme glycolytique à un taux proportionnel aux étapes oxydatives terminales, évitant la production de lactate neurotoxique (Marie et Bralet, 1991) tout en assurant un flux net à travers les portions cytoplasmiques et mitochondriales de la voie à un taux adéquat pour répondre aux demandes énergétiques (Fig. 8).

On ne sait pas comment ce changement remarquable dans la spécificité du substrat (ATP intramitochondrial versus extramitochondrial) est induit par la phosphorylation oxydative, mais il est clair que la conformation de l’enzyme liée à la mitochondrie est affectée par le potentiel de la membrane mitochondriale ainsi que par d’autres facteurs liés à la fonction mitochondriale, indiquant une interaction intime entre les membranes interne (à travers laquelle le potentiel membranaire existe) et externe (à laquelle l’hexokinase est liée) de cet organite (Hashimoto et Wilson, 2000).Les changements de conformation affectant les régions de la molécule impliquées dans la liaison du substrat ATP avaient été précédemment postulés (de Cerquiera et Wilson, 1998) comme étant responsables des changements de spécificité du substrat.