PCR du gène mecA

Un fragment de 188 pb au sein du gène mecA et un fragment de 178 pb au sein du gène S. aureus ont été amplifiés pour les isolats 1 et 2 dans des réactions séparées sur un LightCycler (Roche Diagnostics GmbH, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Allemagne) en utilisant le vert SYBR avec les amorces Mec-S et Mec-A ou Sa442-F et Sa442-RS, respectivement, comme décrit précédemment (5). Les isolats mecA-positifs génèrent des températures de fusion du vert SYBR de 79°C. Les isolats Sa442-positifs génèrent également une température de fusion du vert SYBR de 79°C. S. aureus ATCC 29213 (sensible à l’oxacilline) et S. aureus ATCC 43300 (résistant à l’oxacilline) ont été utilisés comme témoins pour le gène Sa442 et comme témoins négatifs et positifs, respectivement, pour le gène mecA. Contrairement aux témoins, aucun produit mecA ou Sa442 n’a été généré pour les isolats 1 et 2. Une PCR supplémentaire a été effectuée pour détecter un fragment plus large de 533 pb du gène mecA (4). Aucun produit n’a été généré dans les isolats 1 et 2 ou dans S. aureus ATCC 29213, mais un produit de la taille attendue a été généré à partir de S. aureus ATCC 43300. Le gène de l’ARNr 16S, utilisé comme contrôle positif, a été amplifié à partir de toutes les souches (données non présentées).

La détection précise et rapide de la résistance à la méthicilline chez S. aureus est une fonction importante du laboratoire de microbiologie clinique (20). Bien que la détection du gène mecA par PCR soit l’étalon-or, le test d’agglutination au latex PBP2a s’est révélé être un test simple et rapide, avec de bonnes caractéristiques de performance pour détecter la résistance à la méthicilline à la fois chez S. aureus et chez les espèces staphylococciques à coagulase négative, malgré la nécessité d’une induction préalable dans certains cas (1, 21). Le test PBP2a utilise des particules de latex sensibilisées par des anticorps monoclonaux dirigés contre PBP2a (11). La spécificité de ce test serait proche de 100% (18, 19). Bien qu’il n’existe aucun rapport concernant les performances des tests d’agglutination au latex PBP2a pour les isolats de S. intermedius, des résultats faussement positifs au test PBP2a ont été notés avec deux isolats de S. warneri, l’un à 1 min et l’autre à 6 min, qui étaient tous deux négatifs à la PCR mecA avec une CMI de l’oxacilline de ≤0,5 μg/ml (21). Selon la notice du fabricant, les réactions faussement positives sont généralement des agglutinations faibles qui sont souvent négatives lors de la répétition du test avec une culture fraîche. Cependant, nous avons constaté que nos deux isolats étaient positifs de manière répétée après plusieurs sous-cultures, l’un d’entre eux étant fortement positif. La souche S. intermedius ATCC 29663 était, en fait, négative par le test PBP2a, mais elle était également phénotypiquement différente des deux souches cliniques en ce qui concerne la fermentation positive du mannitol, la négativité de la β-lactamase et la sensibilité à la pénicilline (résultats non montrés).

La positivité de la coagulase est couramment utilisée pour attribuer une signification clinique et une pathogénicité aux isolats de Staphylococcus spp. Alors que S. aureus est le staphylocoque coagulase-positif le plus communément isolé dans le laboratoire clinique, S. intermedius, S. delphini, S. schleiferi subsp. coagulans, S. lutrae et certaines souches de S. hyicus sont également coagulase-positifs (1). Les laboratoires utilisent souvent une combinaison de tests pour détecter la coagulase libre ou le facteur de coagulation avec et sans protéine A pour identifier les staphylocoques coagulase-positifs. Les isolats de S. intermedius sont positifs pour la coagulase libre mais sont négatifs pour la protéine A, et 14% des isolats ont un facteur d’agglutination, ce qui expliquerait la coagulase glissante positive et le latex BACTi Staph faiblement positif pour l’isolat 1 (6). Comme nous l’avons décrit précédemment, nous avons trouvé que la positivité de la pyrrolidonyl arylamidase était un moyen rapide de déterminer qu’un staphylocoque coagulase-positif n’est pas S. aureus (10). Nous pensons que nos cas suggèrent que la véritable incidence de S. intermedius dans les infections de plaies chez l’homme est probablement sous-estimée, car tous les staphylocoques à coagulase positive sont souvent assimilés à S. aureus (17). En l’absence d’identification définitive de S. intermedius par des méthodes phénotypiques ou biochimiques, le séquençage du gène de l’ARNr 16S s’est avéré utile pour la classification taxonomique des espèces de Staphylococcus et de Macrococcus (8).

Une première étude réalisée en 1989 a montré que 72% des isolats de S. intermedius provenant de la gencive canine et d’infections de plaies infligées aux canidés étaient sensibles à la pénicilline, et qu’aucun n’était résistant à l’oxacilline (16). Une étude plus récente a révélé que la résistance à l’oxacilline est un problème croissant dans les isolats de S. intermedius, avec des taux de résistance à l’oxacilline de 60 à 85 % plus élevés pour les isolats provenant du nez, des yeux et des abcès de chiens par rapport à ceux provenant des autres sites (7). Dans la première infection humaine due à S. intermedius résistant à la méthicilline, où il était l’agent causal de la pneumonie, la CMI de l’oxacilline était de 32 μg/ml (3). Nos deux isolats étaient résistants à la pénicilline et étaient β-lactamase positifs ; la CMI de l’oxacilline pour ces isolats était de 0,125 μg/ml. La résistance à la pénicilline de ces isolats, en l’absence de résistance à l’oxacilline avec une PCR mecA négative et de sensibilité aux associations β-lactamines/β-lactamases, peut s’expliquer par le résultat positif du test de la β-lactamase. En utilisant l’ensemble d’amorces ciblant un fragment de 533 pb du gène mecA, Gortel et al. ont confirmé que le gène mecA confère une résistance à la méthicilline chez les staphylocoques isolés chez le chien (4). Ces chercheurs ont constaté que parmi 10 souches de staphylocoques coagulase-positifs portant le gène mecA, 9 étaient des S. aureus et 1 des S. intermedius. Ils ont émis l’hypothèse que la différence de prévalence de la résistance à la méthicilline chez S. intermedius par rapport à celle de S. aureus était due à une différence de régulation du mecA entre les espèces ou à l’absence de pression de sélection antibiotique intense sur S. intermedius (4). Bien qu’il n’existe pas de critères d’interprétation spécifiques du NCCLS pour les staphylocoques à coagulase positive autres que S. aureus, les résultats des tests de sensibilité à l’oxacilline par des méthodes phénotypiques et génotypiques (PCR du gène mecA utilisant deux ensembles d’amorces ciblant des fragments de 188 et 533 pb), associés à des CMI d’oxacilline faibles par rapport à celles précédemment rapportées pour les isolats de S. intermedius (MIC > 4 μg/ml), établit que les isolats 1 et 2 de cette étude sont sensibles à l’oxacilline (3, 4).

Il est bien admis que la résistance à la méthicilline chez S. aureus est principalement due à l’acquisition d’une protéine supplémentaire de liaison à la pénicilline, PBP2a, codée par le gène mecA. La recherche de l’origine du gène mecA a conduit à l’identification d’un précurseur évolutif possible chez S. sciuri, un commensal des animaux. L’homologue mecA de S. sciuri présentait une similarité de séquence d’ADN de 79,5 % avec le gène mecA de S. aureus et une identité d’acides aminés de 88 % avec PBP2a. L’homologue mecA de S. sciuri ne confère pas de résistance à la méthicilline dans la nature. Cependant, Couto et al. ont identifié des isolats de S. sciuri résistants à la méthicilline provenant d’humains, où la surexpression de l’homologue mecA résultant de l’insertion d’un élément IS256 en amont du gène de structure ou d’altérations d’un seul nucléotide dans la région du promoteur a entraîné la production d’une protéine ressemblant fonctionnellement à PBP2a (2). Comme les isolats de S. sciuri, les isolats de S. intermedius décrits ici peuvent contenir un homologue mecA codant pour une protéine semblable à PBP2a, qui présente une réaction croisée avec le test d’agglutination au latex PBP2a mais ne confère pas de résistance à la méthicilline. Un mimétisme antigénique avec une protéine totalement non apparentée est également possible. Dans un cas comme dans l’autre, nous espérons sensibiliser la communauté microbiologique à l’existence d’isolats cliniques susceptibles de remettre en cause la spécificité du test d’agglutination au latex PBP2a.

En conclusion, nous fournissons le premier rapport de résultats PBP2a faussement positifs pour deux souches de S. intermedius qui, combinés à une erreur initiale d’interprétation des tests phénotypiques, ont conduit à une identification erronée comme SARM. Des résultats PBP2a faussement positifs pourraient conduire à des tentatives de contrôle de l’infection mal orientées, à l’utilisation inutile d’antibiotiques comme la vancomycine et à une augmentation globale des dépenses hospitalières (20). Ces cas soulignent l’importance de rechercher activement les résultats de tests de laboratoire divergents pour éviter les erreurs de déclaration. L’identification précise des espèces de staphylocoques à coagulase positive est essentielle pour déterminer la pathogénicité, la signification clinique, les profils de sensibilité et l’épidémiologie des isolats cliniques.