2.2. Test d’Ames

Le test d’Ames a été utilisé pour étudier la mutagénicité de Copaifera spp. La méthodologie de préincubation développée par Maron et Ames , avec et sans activation exogène (S9), a été employée pour analyser différentes souches de Salmonella Typhimurium (TA98, TA100, TA97a, et TA102) dans le but d’identifier les agents qui provoquent des mutations génétiques. Les souches d’essai, aimablement fournies par le Dr B.N. Ames (Berkeley, CA, USA), ont été cultivées à partir de cultures congelées pendant 12-14 h, pendant la nuit, dans le bouillon nutritif Oxoid numéro 2.

Pour le test d’activité mutagène, diverses concentrations de chaque oléorésine, de chaque extrait ou d’acide kaurénoïque dissous dans du DMSO ont été ajoutées à 0,1 ml de culture bactérienne dans 0,5 ml de tampon phosphate 0,2 M ou 0,5 ml de mélange S9 à 4% et incubées à 37°C pendant 20-30 min. Les concentrations étaient comprises entre 62,5 et 500 μg/plaque pour le C. lucens (extrait), entre 120 et 1000 μg/plaque pour le C. multijuga (extrait), entre 125 et 1000 μg/plaque pour le C. oblongifolia (oléorésine), entre 500 et 4000 μg/plaque pour le C. langsdorffii (oléorésine), et entre 25 et 200 μg/plaque pour l’acide kaurénoïque. Ces concentrations ont été choisies sur la base d’un test de toxicité préliminaire. Dans tous les essais ultérieurs, la limite supérieure de la gamme de doses testées était soit la dose non toxique la plus élevée, soit la dose toxique la plus faible déterminée lors de l’essai préliminaire. La toxicité a été détectée soit comme une réduction du nombre de révertants de l’histidine (His+), soit comme un amincissement de la pelouse de fond auxotrophe.

Le mélange d’activation métabolique (fraction S9) préparé à partir de foies de rats Sprague Dawley traités avec le mélange de biphényles polychlorés Aroclor 1254 (500 mg/kg) a été acheté auprès de Molecular Toxicology Inc. (Boone, NC, USA) et fraîchement préparé avant chaque test. Le système d’activation métabolique était composé de 4 % de fraction S9, de 1 % de chlorure de magnésium 0,4 M, de 1 % de chlorure de potassium 1,65 M, de 0,5 % de D-glucose-6-phosphate disodique 1 M et de 4 % de sel de sodium de nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADP) 0.1 M dans 50% de tampon phosphate 0,2 M et 39,5% d’eau distillée stérile.

Après incubation, 2 mL de gélose supérieure ont été ajoutés, et le mélange a été versé sur une plaque contenant de la gélose minimale. Les plaques ont été incubées à 37°C pendant 48 h, et les colonies de révertants His+ ont été comptées manuellement.

Les résultats ont été analysés avec le progiciel statistique Salanal 1.0 (Agence américaine de protection de l’environnement, Laboratoire des systèmes de surveillance, Las Vegas, NV, du Research Triangle Institute, RTP, NC, USA) ; le modèle de Bernstein et al. a été adopté. Les données (révertants/plaque) ont été évaluées par analyse de la variance (ANOVA), suivie d’une régression linéaire. L’indice mutagène (MI) a également été calculé pour chaque concentration testée et correspond au nombre moyen de révertants par plaque de test divisé par le nombre moyen de révertants par plaque de contrôle du solvant. Un échantillon a été considéré comme mutagène lorsqu’une relation dose-réponse a été détectée et que l’IM était supérieur à deux (IM > 2) à une ou plusieurs concentrations .

Les mutagènes standard suivants ont été utilisés comme témoins positifs dans les expériences sans mélange S9 : 4-nitro-O-phénylènediamine (10 μg/plaque) pour TA98 et TA97a, azide de sodium (1,25 μg/plaque) pour TA100, et mitomycine C (0,5 μg/plaque) pour TA102. Dans les expériences d’activation de S9, la 2-anthramine (1,25 μg/plaque) a été utilisée comme contrôle positif pour TA98, TA97a et TA100, et le 2-aminofluorène (10 μg/plaque) a été employé comme contrôle positif pour TA102. Le DMSO a servi de contrôle de solvant (100 μL/plaque) et le contrôle négatif correspond au taux de réversion spontanée de chaque souche.

3. Résultats

Le tableau 2 présente le nombre moyen de révertants/plaque (M), l’écart-type (ET) et l’indice mutagène (IM) observés pour les souches de S. Typhimurium souches TA98, TA100, TA102, et TA97a en présence (+S9) ou en l’absence (-S9) d’activation métabolique après traitement de l’échantillon avec l’oléorésine, l’extrait ou le composé cible.

Ni les extraits de feuilles de C. lucens et de C. multijuga, ni les oléorésines de C. langsdorffii et de C. oblongifolia n’ont provoqué de mutations génétiques, comme en témoigne le test d’Ames. L’acide kaurénoïque n’a pas non plus augmenté le nombre de colonies révertantes, il n’a donc exercé d’effets mutagènes à aucune des concentrations testées ni sur aucune des souches évaluées. Le contrôle de solvant (DMSO) n’a pas différé significativement du nombre de révertants par rapport au contrôle négatif.

4. Discussion

Les effets mutagènes exercés par les plantes ne sont pas facilement perceptibles chez l’homme, et des résultats indésirables à long terme tels que le cancer peuvent se manifester. Par conséquent, la littérature scientifique a souligné l’importance du dépistage des plantes médicinales pour leur pouvoir mutagène. Dans ce sens, nous avons examiné ici le potentiel mutagène des Copaifera spp. et de l’acide kaurénoïque à l’aide du test d’Ames. Akyıl et Konuk ont souligné que la détection des agents génotoxiques repose souvent sur l’utilisation de bactéries comme organismes de test. De cette façon, le test d’Ames (ou test Salmonella/microsome) est la méthode la plus couramment utilisée pour détecter les effets mutagènes des agents génotoxiques .

La performance du test d’Ames en utilisant différentes souches est d’une grande importance compte tenu des particularités de chacune d’entre elles par rapport au test. Ainsi, le marqueur hisG46 de la souche TA100 résulte de la substitution d’une leucine (GAG/CTC) par une proline (GGG/CCC). Cette mutation est ramenée à l’état sauvage par des mutagènes qui provoquent des mutations par substitution de paires de bases, principalement sur l’une des paires GC. La mutation hisD3052 portée par la souche TA98 est une mutation de décalage de cadre de lecture de -1 qui affecte le cadre de lecture d’une séquence répétitive voisine -C-G-C-G-C-G-C-G-. La réversion de la mutation hisD3052 vers l’état de type sauvage est induite par divers mutagènes à décalage de cadre tels que le 2-nitrofluorène et divers dérivés nitroso aromatiques de carcinogènes aminés. La mutation hisD6610 de la souche TA97a est également porteuse d’une mutation à décalage de cadre +1 (cytosine), ce qui entraîne une série de 6 cytosines (-C-C-C-C-C-C-). On pense que cette souche est plus sensible à certains des mutagènes qui font réagir la souche TA98. On a développé la souche TA102 qui contient des paires de bases AT au site mutant hisG428. La mutation est portée sur le plasmide multicopie pAQ1. Ce plasmide confère une résistance à la tétracycline, qui est un marqueur pratique pour détecter la présence du plasmide. La mutation hisG428 est une mutation ocre, TAA, dans le gène hisG qui peut être inversée par les six changements possibles de paires de bases, à la fois par des transitions et des transversions. Cette mutation est également inversée par des mutagènes qui causent des dommages oxydatifs, en plus de détecter les agents de réticulation .

En outre, un produit chimique biologiquement actif peut être biotransformé en un métabolite inactif. De même, un produit chimique inactif peut être biotransformé en un métabolite actif . D’où l’importance de l’utilisation de la fraction S9 dans le test d’Ames : elle permet de réaliser des analyses en présence d’un métabolisme et donc d’obtenir des résultats plus fiables.

En ce qui concerne la sécurité, dans nos résultats, ni l’acide kaurénoïque ni les plantes étudiées (extraits et oléorésines) n’ont exercé d’effets mutagènes dans les différentes souches de Salmonella Typhimurium, indépendamment de l’activation S9.

La plupart des articles concernant le genre Copaifera font état d’oléorésines prélevées sur le tronc de l’arbre. Cependant, l’étude des extraits de feuilles est également pertinente car ils contiennent des molécules bioactives prometteuses. En effet, la recherche de la guérison des maladies par l’infusion de feuilles pourrait avoir été l’une des premières façons d’utiliser les produits naturels, une pratique qui est encore adoptée de nos jours .

Plusieurs Copaifera spp. sont populairement employés comme plantes médicinales dans différents pays car ces espèces présentent de nombreuses propriétés pharmacologiques. Comme pour l’acide kaurénoïque, plusieurs effets biologiques ont également été rapportés .

Notre étude est la première à enquêter sur la sécurité des espèces C. lucens et C. oblongifolia et aussi à employer C. langsdorffii en oléorésine pour l’étude de la mutagénicité. Les effets de C. multijuga (oléorésine/extrait) sur l’ADN ont été abordés dans des études précédentes, cependant, en utilisant des techniques différentes par rapport à notre étude qui a utilisé le test d’Ames. Ainsi, nos résultats corroborent les données publiées par d’autres auteurs, qui ont testé d’autres espèces de Copaifera et leurs constituants chimiques, ou ont utilisé des modèles expérimentaux différents, et ont démontré qu’ils n’endommagent pas l’ADN.

De cette manière, l’oléorésine de C. multijuga et son marqueur chimique, l’acide copalique diterpénique, ont été évalués par Alves et al. à travers le test du micronoyau (cellule V79) et le test d’Ames pour l’étude in vitro, ainsi que les tests du micronoyau et des comètes (souris suisses) pour l’essai in vivo. Les données obtenues montrent qu’aucun d’entre eux n’exerce d’effet génotoxique/mutagène dans les conditions expérimentales employées. Comparées à nos résultats, ces données indiquent que pour C. multijuga, tant l’extrait, évalué dans notre étude, que l’oléorésine, évaluée par Alves et al, n’affectent pas le nombre de colonies révertantes par rapport au contrôle négatif dans le test d’Ames ; il en est de même pour l’acide copalique et l’acide kaurénoïque. Ces résultats suggèrent que la mutagénicité est absente, indépendamment de l’activation métabolique.

Dans une étude récente, Furtado et al. ont évalué le potentiel génotoxique de C. multijuga et les résultats ont démontré l’absence de dommages à l’ADN, compte tenu du fait que le traitement à la fois avec l’oléorésine et l’extrait de feuilles de C. multijuga n’augmente pas significativement la fréquence des micronoyaux in vitro (cellule V79) et in vivo (souris suisses). En outre, les auteurs ont également évalué les extraits et les oléorésines d’autres espèces de ce genre, telles que C. duckei, C. reticulata, C. paupera et C. pubiflora et de même que les résultats trouvés pour C. multijuga, l’absence de génotoxicité a été rapportée pour toutes les espèces testées.

Les résultats obtenus dans les études d’Alves et al. et de Batista et al. ont démontré que l’extrait de C. langsdorffii n’a pas augmenté de manière significative la fréquence des micronoyaux (souris suisses) dans le sang périphérique et la moelle osseuse, respectivement. Dans une autre étude, le test des comètes utilisant des rats Wistar n’a révélé aucune différence significative entre les animaux traités avec l’extrait de C. langsdorffii uniquement et le groupe témoin négatif . Ces données montrent que l’extrait ne présente pas de génotoxicité.

Récemment, le test du micronoyau in vivo et le test des comètes utilisant des rats Wistar ont montré que l’extrait de Copaifera malmei n’est pas génotoxique et possède une activité antimutagène. De plus, le test de toxicité subchronique n’a pas révélé de changements toxicologiquement pertinents, comme en témoignent les analyses comportementales, biochimiques et hématologiques jusqu’à 30 jours. Ces résultats indiquent que l’extrait de Copaifera malmei présente une marge de sécurité élevée pour une utilisation thérapeutique. Les déterminations de toxicité et de génotoxicité ont démontré que l’utilisation de l’huile de Copaiba est également sûre : l’évaluation histopathologique n’a pas révélé de changements chez les animaux traités à l’huile de Copaiba, et l’évaluation de la mutagénicité (test du micronoyau ; 2000 mg/kg de poids corporel) n’a pas montré d’effets génotoxiques .

Leandro et al. ont utilisé le test d’Ames pour montrer que l’extrait de C. trapezifolia n’est pas mutagène contre les mêmes souches de Salmonella Typhimurium testées ici, indépendamment de l’activation métabolique.

En ce qui concerne la composition chimique des différentes espèces de Copaifera, les analyses UPLC-MS/MS et CG/MS des oléorésines ont permis d’identifier des diterpènes acides et des sesquiterpènes volatils majeurs, tandis que des teneurs élevées en composés phénoliques incluant des hétérosides flavonoïdes et des dérivés de l’acide galloylquinique ont été vérifiées dans les feuilles . Parmi les constituants de l’oléorésine, les diterpènes sont de loin les principaux composants et comprennent l’acide ent-agathique, l’acide ent-copalique et l’acide ent-kaurénoïque, suivis par les sesquiterpènes comme le β-bisabolène, l’α-humulène et le trans-β-caryophyllène . Dans le cas des extraits hydroalcooliques de feuilles d’espèces Copaifera, ils contiennent principalement de la quercétine, de l’afzéline et des acides quiniques .

Selon Almeida et al. , l’oléorésine de Copaiba (produit commercial) et ses fractions, qui contiennent des sesquiterpènes, des esters méthyliques d’acide diterpène carboxylique, et des niveaux élevés de β-caryophyllène, ne sont pas génotoxiques, comme en témoigne le test des comètes in vivo ou le test du micronoyau. Le β-caryophyllène, principal constituant des oléorésines et des fractions volatiles, ne favorise pas les effets cytotoxiques ou génotoxiques dans les cultures de lymphocytes humains, et il protège contre les dommages à l’ADN induits par le méthane sulfonate d’éthyle . L’évaluation de neuf sesquiterpènes, dont le trans-caryophyllène, par le test d’Ames a montré qu’aucun des composés n’est mutagène .

Dans une étude récente, le traitement de lignées cellulaires de cancer gastrique et de muqueuse gastrique normale avec de l’acide kaurénoïque a montré que la concentration d’acide est fortement corrélée avec l’indice de dommages à l’ADN et avec la fréquence des micronoyaux, déterminés respectivement par le test des comètes et le test des micronoyaux . D’autre part, Cavalcanti et al. ont signalé que de faibles concentrations d’acide kaurénoïque, un diterpénoïde bioactif extrait de C. langsdorffii, n’endommage pas l’ADN et ne modifie pas non plus la fréquence des micronoyaux dans les cellules V79. Une augmentation significative des dommages à l’ADN n’est devenue évidente qu’après l’exposition des cellules à des concentrations plus élevées d’acide kaurénoïque (30 ou 60 μg/mL).

Nous avons ici déterminé la toxicité de l’acide kaurénoïque pour chaque souche de Salmonella Typhimurium évaluée en utilisant des concentrations d’acide partant de la limite de toxicité. Des concentrations plus élevées d’acide kaurénoïque empêchent la croissance bactérienne, ce qui nous a permis d’évaluer le potentiel mutagène de ce composé. Sur la base de nos résultats, les oléorésines testées ici ne sont pas mutagènes, même aux plus fortes concentrations testées.

Selon la littérature, l’utilisation de différents organismes ou de divers systèmes de test peut fournir des résultats distincts . En effet, les systèmes d’essai de génotoxicité et de mutagénicité se divisent en deux groupes. Les méthodes cytogénétiques analysent les eucaryotes et donnent des informations qui varient de la mutation génique aux dommages chromosomiques et aux aneuploïdies. En revanche, les méthodes bactériennes analysent les procaryotes et fournissent des informations sur les mutations génétiques et les lésions primaires de l’ADN causées par un agent.

Ainsi, des tests comme l’échange de chromatides soeurs, l’aberration chromosomique et le micronoyau ont été appliqués pour détecter les lésions de l’ADN au niveau chromosomique dans la biosurveillance humaine tandis que le test de mutagénicité d’Ames Salmonella/microsome a été largement employé pour vérifier l’activité mutagène d’innombrables substances chimiques et extraits bruts de plantes .

Selon Ferguson , les substances peuvent être clastogènes dans le cas des cellules de mammifères, ce qui est le cas des substances utilisées dans le test du micronoyau. Cependant, ces mêmes substances peuvent être négatives dans les tests bactériens tels que le test d’Ames. Il est donc important d’évaluer la sécurité des plantes ou de leurs composés chimiques en se concentrant sur l’évaluation des différents types de dommages génétiques. L’association du test d’Ames à des études in vitro sur cellules de mammifères est recommandée car elles permettent de couvrir plusieurs paramètres mutagènes essentiels (mutations génétiques, lésions chromosomiques structurelles et aneuploïdie) et couvrent également les tests dans les systèmes procaryotes et eucaryotes. En outre, la littérature souligne également que l’étude par le test d’Ames ne doit pas être omise car le test de mutation génique bactérienne détecte tous les modes d’action pertinents conduisant spécifiquement à des mutations génétiques .

Des travaux antérieurs ont observé que les composés peuvent être exclusivement positifs dans une ou plusieurs des lignées cellulaires de mammifères, c’est-à-dire que les résultats positifs ne sont pas soutenus par le test d’Ames ou les tests in vivo . En fait, les résultats obtenus d’abord par le test d’Ames sont ensuite reproduits dans les tests sur les animaux ; par conséquent, l’absence de mutagénicité dans le test d’Ames a permis de produire de nouveaux médicaments avec moins d’effets secondaires. Ces données soulignent l’importance d’études comme la nôtre, démontrant l’absence de mutagénicité des plantes et de leurs principaux composants, en utilisant le test d’Ames.

5. Conclusions

Dans l’ensemble, nos résultats soutiennent l’utilisation sûre des plantes médicinales sélectionnées appartenant au genre Copaifera. Néanmoins, les effets mutagènes de composés uniques pourraient être masqués en raison des effets antagonistes d’autres composés présents dans les extraits ou les oléorésines . Ainsi, nos résultats démontrent également que l’acide kaurénoïque et les plantes médicinales évaluées peuvent être considérés comme potentiellement sûrs pour une utilisation thérapeutique.

Data Availability

Les données utilisées pour soutenir les résultats de cette étude sont incluses dans l’article.

Divulgation

Carlos Henrique Gomes Martins, Flávia Aparecida Resende et Jaqueline Lopes Damasceno ont eu un accès complet à toutes les données de l’étude et assument la responsabilité de l’intégrité des données et de l’exactitude de l’analyse des données.

Conflits d’intérêts

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Contributions des auteurs

Yadira Fernández Arnet, Giovanna Capaldi Fortunato, Luiza Girotto, Gabriel Davi Marena, Beatriz Patti Rocha, Flávia Aparecida Resende, Sergio Ricardo Ambrosio, Rodrigo Cássio Sola Veneziani et Jairo Kenupp Bastos ont apporté des contributions substantielles à la conception et au design, à l’acquisition, à l’analyse et à l’interprétation des données. Jaqueline Lopes Damasceno, Flávia Aparecida Resende et Carlos Henrique Gomes Martins ont participé à la rédaction du manuscrit ou l’ont révisé de manière critique pour en retirer un contenu intellectuel important. Carlos Henrique Gomes Martins et Flávia Aparecida Resende ont accepté d’être responsables de tous les aspects de ce travail. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Remerciements

Les auteurs remercient la CAPES (Coordination pour l’amélioration du personnel de l’enseignement supérieur), le CNPq (Conseil national pour le développement scientifique et technologique) et la Fondation pour la recherche de São Paulo (FAPESP, subventions n° 2011/13630-7 et 2012/25237-0) pour leur soutien financier et l’Université de Franca pour le soutien reçu. Jaqueline Lopes Damasceno a bénéficié d’une bourse de doctorat de la CAPES (Coordination pour l’amélioration du niveau supérieur ou de l’éducation-personnel).