Ciblage génétique dans les cellules souches embryonnaires

Par le processus de ciblage génétique dans les cellules ES, potentiellement toute manipulation génétique désirée peut être introduite dans la lignée germinale des souris. Des séquences génétiques spécifiques peuvent être supprimées de manière constitutive ou conditionnelle (Knock-out), des mutations spécifiques ou des altérations de paires de bases peuvent être effectuées précisément dans un gène d’intérêt et des gènes rapporteurs ou d’autres cassettes d’expression peuvent être introduits dans des emplacements définis du génome (Knock-in). Les séquences murines peuvent être échangées contre des séquences humaines en utilisant cette technologie pour générer des modèles de souris humanisées.

Cette technique peut prendre jusqu’à un an de développement, il est donc essentiel d’investir un temps considérable au début du projet pour s’assurer que la technologie et la stratégie génétique les plus appropriées sont sélectionnées pour le modèle requis. Le noyau transgénique peut fournir des conseils pour ces types de décision et il est essentiel que tous les projets de ciblage soient discutés en détail avec le noyau avant de commencer le travail dans le laboratoire.

Quand une stratégie a été décidée, un vecteur de ciblage est construit et une stratégie de criblage robuste est conçue et testée pour s’assurer que la manipulation génomique requise peut être détectée au niveau génomique. Le vecteur de ciblage est ensuite transfecté dans des cellules ES et les clones recombinants sont criblés pour détecter l’événement de recombinaison homologue souhaité. Ces cellules sont ensuite injectées dans des embryons de préimplantation et les souris chimériques qui en résultent sont utilisées pour la reproduction de la lignée de souris génétiquement modifiées.

Service

Un service flexible est proposé qui peut être décomposé en étapes spécifiques du développement du modèle, en fonction des ressources disponibles.

Initiation du projet – Gratuit

• Consultation avec le groupe pour aborder une technologie appropriée afin d’obtenir un modèle sûr et utilisable
• Criblage des banques de données de pièges à gènes pour les clones de cellules ES préexistants
• Criblage des ressources du consortium Knock-out pour les vecteurs de ciblage préexistants, Clones de cellules ES et modèles

Consultation pour la construction de vecteurs de ciblage – Gratuit

• Analyse de séquence génomique pour identifier les régions qui ont une forte probabilité d’être des régions d’homologie utilisables pour le ciblage de gènes
• Consultation avec le groupe pour aborder la stratégie génétique requise pour obtenir un modèle sûr, modèle utilisable
• La construction du vecteur de ciblage n’est pas fournie par le noyau mais le noyau peut aider à la fourniture de cassettes et de conseils méthodologiques
• L’établissement de la stratégie de criblage n’est pas fourni par le noyau mais le noyau peut aider à la fourniture de cassettes et de conseils méthodologiques. conseils

Ciblage de gènes dans les cellules souches embryonnaires

• Transfection du vecteur de ciblage complété dans des cellules souches embryonnaires
• Isolation et stockage d’au moins 192 clones indépendants de cellules recombinantes
• Préparation de l’ADN et livraison de plaques de 96 puits pour le criblage
• Congélation, expansion des clones positifs putatifs
• Préparation d’ADN supplémentaire à partir des clones positifs putatifs pour le criblage de confirmation
• Analyse du caryotype des clones ciblés

Injection de blastocystes de clones de cellules ES

• Injection de cellules ES dans un embryon préimplantatoire
• Génération et hébergement de chimères pendant un maximum de 3 semaines.
• Recommandations pour la stratégie de reproduction

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