Réactifs de culture cellulaire

Un stock de glycérol de l’ORF d’Akt1 humain a été obtenu comme vecteur pENTR221 de GE Dharmacon (Clone ID 100067600 d’Akt1 humain). Le vecteur de destination modifié (pcDNA/FRT/TO), contenant le SH Tag, a été un don généreux du Dr Matthias Gstaiger (Institut de biologie des systèmes moléculaires, ETH Zurich, Zurich, Suisse). Les cellules HEK293 Flp-In TREx (#R780-07), le mélange enzymatique LR Clonase II (#11791-100), le vecteur pOG44 (#V6005-20), Zeocin (#46-0509), Blasticidin S (#R210-01), Hygromycin B (#10687-010), Tet (#550205) et Dynabeads Protein A (#100.02D) ont été obtenus auprès d’Invitrogen. Xtremegene 9 (#06365787001) a été acquis auprès de Roche. DMEM (#12430-054) et RPMI 1640 (#22400-089) ont été obtenus auprès de GIBCO. La trypsine (#CC5027.010L) a été achetée chez Genetics. Le FBS normal (#SH30070.03) ainsi que le FBS dépisté Tet (#SH30070.03T) ont été obtenus auprès de Hyclone. L’aphidicoline (#A0781-10MG), le nocodazole (#M1404-10MG), l’iodure de propidium (#P4170-250 mg) et la protéase Lys C (#P3428) ont été obtenus auprès de Sigma. Les étiquettes SILAC ont été obtenues auprès de Cambridge Isotope Laboratories, Inc. Le cocktail d’inhibiteurs de protéase (100X) (#78429) et les billes d’agarose anti-HA de Pierce (#26182) ont été obtenus auprès de Thermo Scientific. Les billes MagStrep ‘Type 2HC’ (#2-1612-002) ont été obtenues auprès d’IBA BioTagnology. Bioconcept Labs Pvt Ltd, Gurgaon, Inde, a synthétisé le peptide HA. La membrane en nitrocellulose (#RPN303E) a été achetée auprès de GE Healthcare. La trypsine protéase (#4370282) a été fournie par AB Sciex. Le marqueur de poids moléculaire des protéines arc-en-ciel (#RPN800E) provient d’Amersham. Les siRNA, le réactif de transfection Dharmafect (#T-2001-03), l’eau sans RNase (#B-003000-WB-100), le tampon siRNA 5X (#B-002000-UB-100) proviennent de Dharmacon. La RNase A (#19101) provient de Qiagen.

Anti-corps pour Western Blot

Les anticorps utilisés dans la présente étude étaient : anti-HA (#SC-7392 ; monoclonal de souris, dilution 1:3000) ; anti-AKT1 (#SC-5298 ; monoclonal de souris, dilution 1 :1000) et anti-GAPDH (#SC-25778 ; polyclonal de lapin, dilution 1:1000) de Santa Cruz ; anti-CDC2 (#77055 ; polyclonal de lapin, dilution 1:1000) ; anti-CCNB1 (#4138 ; polyclonal de lapin, dilution 1 :1000) de Cell Signalling Technology ; anti-BUB3 (#ab133699 ; monoclonal de lapin, dilution 1:10000) ; anti-API5 (#ab56392 ; monoclonal de souris, dilution 1:1000) et anti-SH3PX1 (#EPR14399 ; monoclonal de lapin, dilution 1 :2000) d’Abcam ; les anticorps secondaires ont été fournis par Licor Biosciences – Odyssey chèvre anti-souris (#926-32210, dilution 1:15000) et Odyssey chèvre anti-lapin (#926-32211, dilution 1:15000).

Génération d’une lignée cellulaire stable

Dans cette étude, le vecteur d’entrée Akt1 compatible avec la passerelle (pENTR221) a été utilisé pour générer une construction d’expression par réaction de recombinaison LR en présence d’un vecteur de destination approprié (pcDNA/FRT/TO). Le vecteur de destination a été modifié pour inclure un tag Strep-HA (SH) contenant un peptide de liaison à la streptavidine (Strep) et un tag épitope d’hémagglutinine (HA). Cette étiquette SH a finalement été utilisée pour extraire sélectivement Akt1 et ses partenaires d’interaction de lysats cellulaires complexes. Pour générer une lignée cellulaire d’expression inductible d’Akt1, la construction d’expression a été co-transfectée avec la recombinase pOG44 dans des cellules HEK293 Flp-In TREx, exprimant de manière stable le répresseur Tet. La transfection a été facilitée par le réactif de transfection Xtremegene 9. Les cellules exprimant la construction Akt1 ont été sélectionnées sur une période de 15 à 20 jours dans un milieu RPMI contenant de l’hygromycine-B (75 µg/ml), complété par 10 % de FBS dépisté par Tet. Ces cellules sélectionnées ont ensuite été regroupées pour être développées pour des expériences de pulldown.

La concentration de Tet nécessaire pour une expression optimale d’Akt1 a été déterminée en induisant l’expression d’Akt1 sur une gamme de concentrations de Tet (0,1 µg/ml à 5 µg/ml) et les niveaux d’expression de la protéine d’Akt1 ont été suivis en présence et en absence de Tet en utilisant l’anticorps anti-Akt1 ainsi que l’anticorps anti-HA. Tet a été ajouté au milieu de culture toutes les 24 heures pour maintenir une expression stable d’Akt.

Expérience de PDT

PDT pour les cellules HEK293 a été surveillé dans les cellules normales par rapport aux cellules surexprimant Akt1 sur une durée de 72 heures après l’administration initiale de Tet. Pour chaque point d’observation, un ensemble parallèle de 104 cellules HEK293 normales et surexprimant Akt1 a été ensemencé en triplicatas, dans une plaque de 96 puits dans 100 µl de milieu DMEM contenant 10% de sérum. Le Tet a été ajouté au milieu de culture 24 heures après l’ensemencement et après un autre intervalle d’incubation de 24 heures, les cellules ont été récoltées au temps 0. Par la suite, un ensemble de cellules, en culture parallèle, a été récolté toutes les 24 heures jusqu’à 72 heures. La TPD a été déterminée en comptant les cellules à chaque point de temps par la méthode de coloration au bleu trypan.

Marquage SILAC pour différencier l’interactome d’Akt1 spécifique de la phase du cycle cellulaire

Les cellules HEK293 surexprimant Akt1 ont été expansées et cultivées dans des milieux SILAC contenant des isotopes « légers » (K0R0), « moyens » (K6R6) ou « lourds » (K8R10) de lysine (K) et d’arginine (R) pendant au moins 5 doublements cellulaires pour permettre l’incorporation complète des marqueurs. A 70% de confluence, Tet (1 µg/ml) a été ajouté au milieu pour induire l’expression d’Akt1. Les cellules marquées au K0R0 ont été arrêtées en phase G0 par privation de sérum pendant une nuit, ce qui est une méthode largement utilisée pour arrêter les cellules en phase G042. Pour ce faire, le milieu de culture complet normal a été remplacé par du RPMI privé de sérum et les cellules ont été maintenues en culture pendant 16 à 18 heures à 37 °C dans une atmosphère à 5 % de CO2. Les cellules marquées au K8R10 ont été arrêtées en phase G1/S en les cultivant pendant une nuit en présence de 5 µg/ml d’aphidicoline, un inhibiteur réversible de la réplication de l’ADN nucléaire eucaryote43. De même, pour l’arrêt de la phase G2, 400ng/ml de nocodazole ont été ajoutés au milieu de culture des cellules marquées K6R6 et l’incubation a été poursuivie pendant 16-18 heures avant d’éliminer les cellules. Le nocodazole interfère avec la polymérisation des microtubules, arrêtant ainsi les cellules en phase G2/M44. Les cellules arrêtées ont été trypsinées et comptées séparément par la méthode de coloration au bleu trypan. Les cellules arrêtées dans les différentes phases du cycle cellulaire ont ensuite été culottées par centrifugation à 1500 rpm pendant 10 minutes. Plusieurs culots cellulaires ont été réalisés pour chaque phase du cycle cellulaire et stockés à -80 °C, jusqu’à leur utilisation.

Purification d’affinité avec marquage SH

Le même nombre de cellules surexprimant Akt1 arrêtées en phases G0, G1/S et G2 ont été mélangées dans un rapport de 1:1:1 et lysées sur glace pendant 1 heure dans un tampon IP (150 mM NaCl ; 50 mM Tris-HCl pH7,5 ; 1% NP-40 ; cocktail d’inhibiteurs de protéase 1X et 1 mM PMSF). Le lysat cellulaire a été débarrassé des débris après une séparation par centrifugation à 10 000 rpm pendant 15 minutes à 4 °C. Les complexes protéiques d’Akt1 ont été purifiés sélectivement dans des ensembles parallèles en ciblant simultanément les étiquettes Strep et HA, comme indiqué dans les manuels des kits respectifs. En bref, les complexes protéiques d’Akt1 marqués par Strep ont été mélangés avec 100 µl de billes magnétiques de streptactine et maintenus pendant 1 heure d’incubation sur un agitateur rotatif à 4 °C. Tout interacteur non spécifique a été éliminé au cours de cinq étapes de lavage consécutives avec cinq volumes de billes de tampon de lavage streptactine. La protéine Akt1 et ses interacteurs ont finalement été élués en deux étapes d’élution avec 125 µl de tampon d’élution strep par élution (invitrogen). Pour la purification des complexes protéiques d’Akt1 marqués HA, les lysats cellulaires nettoyés ont été incubés avec 50 µl de billes d’agarose HA prélavées pendant 2 heures à 4 °C sur un agitateur rotatif. Après 3 lavages rapides, avec dix volumes de tampon TBS-T pour les billes, les complexes protéiques Akt1 ont été élués trois fois avec 50 µl de peptide HA (250 µg/ml). Les étapes de purification ci-dessus ont été réalisées pour trois réplicats biologiques de ce type afin de purifier la protéine Akt1 et ses partenaires d’interaction et les éluats Strep et HA de chaque réplicat ont été regroupés, lyophilisés et conservés à -80 °C jusqu’au traitement ultérieur.

Digestion des protéines et préparation des échantillons pour LC-MS/MS

Les trois réplicats biologiques ont été traités pour la digestion des protéines séparément. A l’échantillon lyophilisé, 40 µl de bicarbonate d’ammonium 100 mM ont été ajoutés, bien vortexés, suivis de l’ajout de 2 µl de tampon dénaturant (AB Sciex). Les échantillons ont été réduits avec 4 µl de réactif réducteur (AB Sciex) pendant 1 heure à 60 °C. 2 µl de réactif bloquant la cystéine ont été ajoutés pendant 10 minutes à température ambiante pour bloquer les résidus de cystéine réduits. La digestion des protéines a été initiée par l’ajout de 5 µl d’endo-protéinase Lys C à 0,1 µg/µl. Les échantillons ont été maintenus en incubation pendant 4 heures dans un bain-marie à 37 °C. Après une courte rotation, 1 µl de trypsine (1 µg/µl) a été ajouté aux échantillons et l’incubation s’est poursuivie pendant 12-16 heures à 37 °C. La digestion des protéines a été terminée par l’ajout d’une goutte d’acide formique (FA).

Les échantillons acidifiés ont été lyophilisés et soumis à une purification peptidique en utilisant des colonnes C-18 monospin. Avant leur utilisation, les colonnes C-18 ont été conditionnées avec du méthanol et de l’eau, puis équilibrées avec 3 % d’ACN dans 0,1 % d’AF. Les échantillons lyophilisés ont été dissous dans de l’ACN à 3% dans 0,1% de FA et chargés sur les colonnes C-18 et laissés se lier pendant 10 minutes. Les échantillons ont été passés deux fois dans les colonnes pour assurer une liaison complète. Après 10 lavages rigoureux avec de l’ACN à 3 % dans 0,1 % de FA, les peptides digérés ont été élués d’abord dans de l’ACN à 40 %, puis deux élutions dans de l’ACN à 60 %. Enfin, les trois éluats ont été regroupés et lyophilisés, pour chaque réplique.

Les peptides élués ont été redissous dans 500 µl de formiate d’ammonium 5 mM (pH 2,5) dans 30% d’ACN et doucement vortexés. La cartouche échangeuse de cations a été fixée et conditionnée avant le chargement de l’échantillon. Après le chargement de l’échantillon, la cartouche a été lavée trois fois avec du formiate d’ammonium 5 mM (1 ml). Les peptides ont été ré-élués deux fois avec 400 µl de formate d’ammonium 500 mM (pH 2,5) dans 30% d’ACN par élution et les éluats ont été regroupés pour chaque réplique d’échantillon et lyophilisés.

Spectrométrie de masse Plan d’expérience et justification statistique

Analyse CL-MS/MS

Tous les échantillons ont été analysés par chromatographie liquide à nanoflux sur un système nanoflex (Eksigent Technologies, AB Sciex) couplé à un spectromètre de masse triple TOF 5600 (AB Sciex ; Concord, Canada). Chaque réplicat biologique a été injecté deux fois en tant que réplicats techniques. Le système a fonctionné en utilisant un gradient de phase binaire, avec le solvant A (2 % d’ACN dans 0,1 % de FA) et le solvant B (98 % d’ACN dans 0,1 % de FA). Pour une reproductibilité optimale de la distribution de l’échantillon, le passeur automatique d’échantillons a fonctionné en mode d’injection complète en remplissant la boucle de 1 µl avec 3 µl d’échantillon. Pour les mesures de chaque injection d’échantillon, les peptides ont été piégés sur un piège cHiPLC, 3 µm, Chrom XP C18CL, 120 Å, 0,5 mm × 200 µm (Eksigent) et séparés sur une colonne cHiPLC, 3 µm, Chrom XP C18CL, 120 Å, 15 cm × 75 µm (Eksigent) à un débit de 300 nl/minute, en utilisant un gradient linéaire : 5-60% de solvant B en 80 minutes, 60-90% pendant 2 minutes. La colonne a été régénérée par lavage avec 90% de solvant B pendant 6 minutes et rééquilibrée avec 5% de solvant B pendant 22 minutes.

Le spectromètre de masse était couplé à une source d’ions Nano Spray (AB Sciex), contrôlée par le logiciel Analyst (v.1.6). La source d’ions était équipée d’un émetteur d’électrospray PicoTip de 10 μm de SilicaTip (AB Sciex) et les peptides élués ont été suivis par les paramètres suivants de la source d’ions : IHT = 130°, ISVF = 2100 v, GS1 = 20, gaz de rideau = 25. Le spectromètre de masse a fonctionné en mode d’acquisition dépendant de l’information (IDA) top10 et en mode haute sensibilité avec un temps d’accumulation de 500 et 200 ms pour les balayages MS1 et MS2 respectivement, et une exclusion dynamique de 12 s, ce qui donne un cycle d’utilisation total de ~2,55 s. L’analyse du spectromètre de masse a été effectuée en utilisant des balayages de sondage TOF-MS1 et MS2 allant de 350 à 1250 et de 140 à 1600 m/z, respectivement. L’énergie de collision de roulement a été automatiquement contrôlée par le script de paramètres d’énergie de collision de roulement IDA. Les critères de sélection de l’ion parent à fragmenter comprenaient l’intensité – où les ions devaient être supérieurs à 150 cps, la tolérance de masse de 50mDa, avec un état de charge de +2 à +5. Un calibrage automatique des spectres a été effectué après l’acquisition de tous les 2 échantillons en utilisant des acquisitions LC-MS et MS/MS dynamiques de 25fmol de β-galactosidase.

Traitement et analyse des données

L’acquisition par MS-MS d’Akt1 et de ses partenaires protéiques en interaction a été médiatisée dans 3 phases différentes du cycle cellulaire à savoir la phase G0, G1/S et G2. Les cellules marquées au SILAC représentant chaque phase ont été regroupées en trois ensembles séparés et sondées en tant que réplicats biologiques. L’acquisition de chaque réplique biologique a donné lieu à 2 fichiers wiff et 2 fichiers wiff.scan, représentant ses répliques techniques. Les fichiers Wiff ont de nouveau été regroupés pour chaque réplique biologique avant d’être recherchés dans la base de données UniProtKB/SwissProt Human (version avril 2015) à l’aide du logiciel protein pilot, version 4.5 (révision n°1656). La base de données de référence comprenait 20 204 entrées de protéines dans la version spécifiée. La recherche de protein pilot était basée sur l’algorithme paragon, qui fait partie des statistiques par défaut du logiciel. Les paramètres suivants ont été utilisés pour les recherches paragon : (a) Espèce : Homo sapiens, (b) Lys C et Trypsin comme catégories d’enzymes pour les différents passages, (c) Clivages manqués maximum = 2, (d) Modifications fixes comme étiquettes SILAC – K6R6 et K8R10 ; alkylation de la cystéine par méthanethiosulfonate de méthyle (MMTS), (e) modifications variables comme l’oxydation de la méthionine, qui est une option par défaut dans protein pilot, (f) identification, SILAC (Lys + 6, Arg + 6) et SILAC (Lys + 8, Arg + 10) comme types d’échantillons, et (g) paramètre « Search Effort » « Thorough ID », qui nous donne une recherche large de diverses modifications de protéines, (h) tolérance de masse pour les ions précurseurs et fragmentaires étaient de 0.05 et 0,1 Da, respectivement. Pour chaque réplique biologique par étiquette SILAC, des fichiers digérés par Lys C et Trypsin ont été générés. Les paramètres suivants ont été utilisés pour filtrer les données afin d’obtenir un ensemble de données fiables pour une analyse ultérieure : (a) L’algorithme de correction automatique du biais pour le rapport lourd/léger a été appliqué. Il corrige le mélange inégal pendant la combinaison des différents échantillons marqués dans une expérience et élimine tout biais expérimental ou systématique. Le facteur de biais automatique augmente la précision de la quantification en normalisant les variations dans les quantités initiales de protéines45, (b) Les protéines à un taux de fausse découverte (FDR) global de 1% par rapport à l’ajustement (G-FDR-fit) ont été retenues. L’analyse FDR a été réalisée à l’aide du logiciel Proteomics Performance Evaluation Pipeline Software (PSPEP) qui est installé avec le logiciel protein pilot ; (c) Le seuil de confiance minimal des protéines a été fixé à 95 % ; (d) Identification d’au moins un peptide unique avec un niveau de confiance de 95 % dans les trois réplicats.

Les listes de protéines acquises après la digestion par Lys C et Trypsine ont été regroupées par réplicat biologique. Les rapports de quantification entre les protéines moyennement et lourdement marquées SILAC par rapport à leurs homologues plus légères ont été moyennés. Par la suite, nous avons obtenu trois listes de protéines par marqueur SILAC – K0R0, K6R6 et K8R10. Nous avons ensuite préparé une liste d’union des protéines identifiées ; L’estimation quantitative a été établie manuellement en fusionnant les fichiers de trois réplicats biologiques pour chaque condition SILAC. Les protéines qui ont été identifiées dans les trois ensembles de réplicats ont été retenues pour une analyse ultérieure et les rapports quantitatifs entre les étiquettes moyennes et lourdes par rapport aux étiquettes légères pour ces protéines ont été moyennés. Un fichier combiné final a ensuite été préparé pour K0R0 (phase G0), K6R6 (phase G2) et K8R10 (phase G1/S). Une protéine ne pouvait figurer dans la liste finale des interactants d’Akt1 que si elle était identifiée dans les 3 ensembles de répliques pour n’importe quelle phase du cycle cellulaire. Les protéines identifiées mais non quantifiées dans les trois répétitions se sont vues attribuer une valeur de quantification de 0,01 (minimum) ou 100 (maximum) après avoir été intégrées dans les ratios SILAC peptidiques.

Pour élaguer davantage la liste des interactants d’Akt1 de toute interaction non spécifique avec la matrice d’affinité ou l’étiquette en soi, la GFP étiquetée SH a été surexprimée dans des cellules HEK293. Les partenaires d’interaction de la protéine GFP ont été élués sélectivement comme décrit pour les complexes protéiques Akt1. Les protéines qui chevauchaient l’interactome spécifique de la phase du cycle cellulaire d’Akt1 ont été retirées de la liste des interactants d’Akt1 en tant que protéines non spécifiques. Ceci nous a finalement permis d’obtenir un ensemble de données fiables sur les partenaires d’interaction d’Akt1. Un résumé des informations sur les protéines interagissant avec Akt1 et leurs estimations de quantification est fourni dans le tableau supplémentaire 3. En les divisant avec le ratio d’Akt1 dans la phase respective, on a normalisé les ratios quantitatifs pour tous les interacteurs d’Akt1. Cela a donné une uniformité à Akt1 comme 1 dans les phases G0, G1/S et G2.

Électrophorèse sur gel de polyacrylamide et Western blotting

De la liste des interacteurs Akt1 identifiés, CDK1, CCNB1, BUB3, API5 et SH3PX1 ont été sélectionnés au hasard pour valider leur association avec Akt1 par western blotting. Le culot des cellules exprimant Akt1 asynchronisé a été lysé dans un tampon IP et soumis à une purification par affinité ciblant le tag SH comme décrit précédemment. Les éluats ont été regroupés et dilués dans un tampon d’échantillon SDS 1X, chauffés pendant 10 minutes et résolus sur SDS-PAGE à 10%. Les bandes de protéines ont été transférées sur une membrane de nitrocellulose et cette dernière a été bloquée en utilisant le tampon de blocage odyssée 1:1 : PBS pendant une heure à température ambiante. Ensuite, la membrane a été découpée pour permettre aux protéines de différentes tailles d’être sondées avec les anticorps primaires respectifs à valider avec l’anticorps anti-HA. La dilution de l’anticorps primaire a été faite dans le tampon odyssée : PBST et incubée pendant la nuit à 4 °C sur un agitateur. Après un lavage complet, les blots ont été exposés à des anticorps secondaires anti-souris ou anti-lapin marqués à l’IR à une dilution de 1:15000 ; dilués dans le tampon odyssée : PBST. Les bandes ont été détectées à l’aide d’un scanner infrarouge odyssey.

Une co-immunoprécipitation inverse a également été réalisée à l’aide de Dynabeads protéine A. Les interactants d’Akt1 précédemment détectés ont été utilisés comme protéines appâts et Akt1 a été sondé comme leur partenaire d’interaction à l’aide d’un anticorps anti-Akt1. Les anticorps contre les interactants d’Akt1 sélectionnés ont été mélangés avec 50 µl de dynabeads dans des tubes séparés à une concentration de 1:20-1:70 ; dilués dans 200 µl de PBST. Les mélanges billes-anticorps ont été conservés pour une incubation à température ambiante pendant 10 minutes. Les complexes billes-anticorps ont été granulés à l’aide d’un séparateur magnétique et remis en suspension dans 200 µl de PBST pour le lavage. Ensuite, 250 µl de lysat ont été ajoutés à chaque tube et maintenus en incubation à 4 °C pendant 2 heures sur un agitateur rotatif. Les billes ainsi que les complexes anticorps-antigène respectifs ont été à nouveau granulés et lavés trois fois avec 200 µl de PBST, par lavage. Ensuite, les billes ont été bouillies dans 50 µl de tampon d’échantillon SDS 1X pendant 10 minutes, puis refroidies. Le surnageant a été chargé sur SDS-PAGE à 10% et sondé par western blotting. L’anticorps anti-Akt1 a été utilisé pour détecter Akt1 dans l’élution de API5, CCNB1, CDK1, BUB3 et SH3PX1.

Classification des OG

Les classes d’OG décrivant la fonction de chaque interacteur d’Akt1 ont été déterminées à partir des bases de données UniProt (http://www.uniprot.org/) et EnrichR (http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/). Après une sélection manuelle approfondie, les interactants d’Akt1 identifiés ont été répartis en 3 classes fonctionnelles majeures, à savoir la prolifération et la survie, le métabolisme et la synthèse des protéines. Le reste a été représenté comme une classe commune appelée « autres » qui comprenait des protéines avec des fonctions telles que le transport, l’hématopoïèse, etc.

Le knockdown génique en utilisant le siRNA

Standardisation

Pour déterminer la concentration optimale de siRNA pour la transfection, 1,2 × 105 cellules HEK293 ont été ensemencées dans une plaque à 12 puits. le siRNA contre PLK1 a été utilisé comme contrôle positif dans tous les essais de knockdown. Une gamme de concentrations de siRNA allant de 10 nM à 50 nM a été transfectée en utilisant le réactif de transfection dharmafect, conformément au protocole du fournisseur. Les changements dans les niveaux d’expression des protéines ont été suivis par western blotting à 24 heures, 48 heures et 72 heures, respectivement (figure supplémentaire 2). Quelques cibles supplémentaires (SH3PX1, AKT1, CCNB1 et SLC25A5) ont été désactivées et l’effet de la désactivation a été déterminé par western blotting. La GAPDH a été utilisée comme contrôle de charge.

Knockdown des protéines cibles

Les protéines montrant une association perturbée avec Akt1 alors que la cellule progresse de la phase G0 à la phase G1/S du cycle cellulaire ont été knocked down individuellement dans les cellules HEK293 et étudiées par FACS. Chaque siRNA a été remis en suspension dans un tampon siRNA 1x pour obtenir une concentration stock de 20 µM. La transfection a été effectuée en triplicatas 24 heures après l’ensemencement des cellules, avec des contrôles positifs et négatifs appropriés. Chaque siRNA a été dilué à une concentration de travail de 25 nM dans du RPMI pour obtenir un volume final de 50 µl et maintenu à température ambiante pendant 5 minutes d’incubation. De même, le réactif de transfection a également été dilué dans du RPMI pour obtenir un volume de 50 µl et conservé pour une incubation dans des conditions similaires. Le siRNA et le réactif de transfection ont été mélangés doucement pour former des complexes et l’incubation s’est poursuivie pendant 20 minutes supplémentaires à température ambiante. Le volume final a été porté à 500 µl avec un milieu contenant 10% de sérum. Ces complexes ont ensuite été délicatement ajoutés aux cellules et l’incubation s’est poursuivie à 37 °C. Le milieu de culture cellulaire a été remplacé par du milieu frais à 10 % après 24 heures. Enfin, 48 heures après la transfection, l’efficacité de la transfection a été déterminée par le suivi du siGLO sous microscope inversé Nikon Ti.

Acquisition et analyse FACS

Au bout de 48 heures après la transfection, les cellules ont été brièvement centrifugées et le milieu a été aspiré. Les cellules ont été colorées avec 300 µl d’une solution d’iodure de propidium contenant 0,1 mg/ml d’iodure de propidium (Sigma), 3 µl/ml de Triton-X 100 (Sigma), 1 mg/ml de citrate de sodium (Sigma) et 20 µg/ml de RNase (Sigma) pendant 30 minutes à 4 °C. Les cellules colorées ont été immédiatement transférées dans des tubes BD FACS et acquises dans BD FACS Canto.

Les données obtenues ont été analysées avec le logiciel FlowJo. Les histogrammes d’ADN ont été analysés pour quantifier les populations sous G0, G0/G1, S et G2/M. Des décalages mineurs ont été observés dans les populations G0/G1 et G2/M et donc un gating manuel a été effectué pour analyser ces populations.

Calcul du PDT et du RT

Le PDT et le RT aux phases G1, S et G2 du cycle cellulaire ont été calculés suite au knockdown par siRNA de l’ensemble des protéines montrant une association perturbée avec Akt1 en phase G1/S. La TDP pour les 23 gènes, ainsi que les contrôles, a été surveillée dans des cellules HEK293 sur une durée de 72 heures. En bref, 10 000 cellules ont été ensemencées dans une plaque à 96 puits, dans 100 µl de milieu RPMI avec 10 % de sérum. La transfection par siRNA a été effectuée le lendemain en trois exemplaires pour chaque protéine cible et a été considérée comme un point temporel de 0 heure. Le nombre de cellules a été déterminé pour les cellules HEK293 non traitées par la méthode de coloration au bleu trypan. Après 24 heures, le milieu de culture cellulaire contenant les complexes de siRNA a été remplacé par du RPMI frais contenant 10 % de sérum. Ensuite, les cellules ont été comptées pour chacune des cellules transfectées par le siRNA pour représenter le point de temps de 24 heures. Par la suite, un ensemble de cellules, fonctionnant en culture parallèle, ont été récoltées et comptées aux points de temps de 48 heures et 72 heures, respectivement.

Une fois que le TPD a été déterminé pour tout l’ensemble ciblé de gènes perturbés, les TR (en heures) de chacun ont été calculés pour les phases G1, S et G2 comme suit :

where; % de la population de cellules ont été déterminés par acquisition FACS.

Data Availability

Les données de spectrométrie de masse ont été déposées en tant que jeu de données « Defining the Akt1 interactome and delineating alterations in its composition as a function of cell cycle progression. » à ProteomeXchange via la base de données PRIDE. Il est disponible publiquement via ProteomeXchange avec l’identifiant ProteomeXchange : PXD005557. L’ensemble de données se compose de 12 fichiers bruts (wiff et wiff.scan) et de 18 fichiers pilotes de protéines associés.