Matériau végétal

Les feuilles de Strychnos spinosa Lam. ont été collectées en janvier 2013 dans le village de Sakara, à Zaria, au Nigeria. Le matériel végétal a été identifié par Musa Muhammad un botaniste de la section herbier du département des sciences biologiques (Université Ahmadu Bello, Zaria) où un spécimen de référence (n° 900161) a été déposé. Les feuilles collectées ont été séchées dans une pièce ventilée à l’abri de toute contamination, puis broyées en poudre à l’aide d’un moulin Macsalab (Modèle 2000 LAB Eriez), conservées dans un récipient en verre et stockées dans l’obscurité à température ambiante (25 ± 3°C) avant utilisation.

Extraction et fractionnement liquide-liquide

Extractions à l’acétone, au méthanol et au dichlorométhane/méthanol

Une variante de la méthode de Suffness & Douros a été utilisée pour fractionner les composants présents dans les différents extraits de feuilles. La poudre de feuilles séchées (2 kg) a été macérée trois fois dans de l’acétone (6 l) pour donner l’extrait acétonique (AcetE, 75 g) après filtration et élimination du solvant sous vide. Les résidus ont ensuite été macérés dans du méthanol (6 l) en suivant la même procédure que celle décrite pour l’extraction à l’acétone ci-dessus pour donner l’extrait au méthanol (MetE, 119,2 g). Une partie des feuilles séchées en poudre (1 kg) a également été extraite dans un mélange (1/1, v/v) de dichlorométhane/méthanol (3 l) trois fois pour donner l’extrait de dichlorométhane/méthanol (DcmMetE, 114 g) après filtration et élimination du solvant sous vide. Une partie de l’extrait acétonique (70 g) a été dissoute et fractionnée dans un mélange (1/1, v/v) de chloroforme et d’eau pour donner les fractions eau et chloroforme. Du n-butanol a été ajouté à la fraction eau pour donner les fractions n-butanol (nButF, 25,1 g) et eau (Wat1, 5 g). La fraction chloroforme a été concentrée à sec et dissoute dans de l’eau à 10% dans du méthanol avant l’extraction avec de l’hexane. La fraction hexane (HexF, 23,9 g) et le résidu de 10% d’eau dans le méthanol ont donc été obtenus après addition de n-hexane. La proportion d’eau dans le méthanol a été augmentée pour obtenir un composant à 35% d’eau dans le méthanol qui a finalement donné des fractions chloroforme (ChlF, 7,05 g) et 35% d’eau (wat2, 2,8 g) après addition de chloroforme. A partir de la CCM comparative, les fractions eau (Wat1) et 35% d’eau dans le méthanol (Wat2) ont été combinées en une seule fraction (WatF, 7,8 g).

Extraction des alcaloïdes

Les feuilles de S. spinosa (1 kg) ont été macérées avec le mélange (96:3:1, v/v) d’EtOAc-EtOH-NH4OH (600 ml) puis percolé avec de l’EtOAc pour donner l’extrait (26 g) après élimination du solvant par évaporateur rotatif sous pression réduite. L’extrait a été dissous dans de l’EtOAc et extrait avec de l’acide acétique à 4% pour obtenir la fraction EtOAc (EtAcF, 20,02 g). La solution acide (pH 3-4) a été basifiée à pH (8-9) avec Na2CO3 et extraite trois fois avec DCM pour donner un extrait brut d’alcaloïdes (AlkE, 2,8 g) après élimination du solvant sous vide.

Dosage antimicrobien

Microorganismes et préparation de l’inoculum

Les microorganismes utilisés étaient trois bactéries Gram positives, Bacillius cereus (ATCC 14579), Staphylococcus aureus (ATCC 29213) et Enterococcus faecalis (ATCC 29212), une bactérie Gram négative, Escherichia coli (ATCC 25922) ; et quatre champignons dont trois levures, Candida albicans, Cryptococcus neoformans (isolats animaux) et Candida albicans (ATCC 10231) et un champignon filamenteux Aspergillus fumigatus. Certaines souches fongiques utilisées ont été cultivées à partir de cas cliniques de maladies infectieuses fongiques chez les animaux, avant traitement, au Département des maladies tropicales vétérinaires de la Faculté des sciences vétérinaires. C. albicans a été isolé d’un pinson gouldien, C. neoformans d’un guépard, tandis que A. fumigatus a été isolé d’un poulet qui souffrait d’une mycose systémique.

Les cultures bactériennes et fongiques ont été prélevées sur des plaques de culture en gélose fraîches de 24 heures et inoculées dans du bouillon dextrose Sabouraud (SDB) frais pour les champignons et du bouillon Mueller-Hinton (MHB) (Fluka, Suisse) pour les bactéries, avant de réaliser le test. La turbidité de la suspension microbienne a été ajustée à une norme McFarland 0,5 équivalente à des concentrations de 1-5 × 108 et 1-5 × 107 cfu/ml pour les bactéries et les champignons, respectivement. Les suspensions microbiennes ont été encore diluées (1:100) dans des milieux pour obtenir un inoculum final d’environ 1,5 × 106 cfu/ml pour les bactéries et 1,5 × 105 cfu/ml pour les champignons.

Détermination de la concentration minimale inhibitrice

Une méthode de microdilution en série double avec du violet de tétrazolium comme indicateur de la croissance microbienne a été utilisée pour déterminer les valeurs de concentration minimale inhibitrice (CMI) des extraits et des fractions contre les bactéries et les champignons, telle que modifiée par Masoko et al. .

A 100 μl (10 mg/ml) d’extraits et de fractions dissous dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) ont été dilués en série deux fois avec de l’eau distillée stérile dans des plaques de microtitrage à 96 puits et 100 μl de culture microbienne fraîchement préparée dans du MHB ou du SDB ont été ajoutés à chaque puits. Le DMSO (5%) a été utilisé comme contrôle négatif tandis que la gentamicine et l’amphotéricine B (1 mg/ml) ont été des contrôles positifs. Les plaques de microtitrage ont été scellées dans des sacs en plastique et incubées pendant 24 h à 37°C. Ensuite, 40 μl de 0,2 mg/ml de violet de p-iodonitrotetrazolium (INT) ont été ajoutés à chaque puits et les plaques de microtitrage ont été incubées à nouveau à 37°C. Les concentrations minimales inhibitrices ont été déterminées après 1 et 2 h pour les bactéries, et 16 et 36 h pour les champignons. La CMI a été déterminée comme la plus faible concentration inhibant la croissance microbienne, indiquée par une diminution de l’intensité de la couleur rouge du formazan.

Dossiers antioxydants

Les activités antioxydantes des extraits et des fractions des feuilles de S. spinosa ont été déterminées en termes de capacité de piégeage des radicaux libres en utilisant le 2,2′-diphényl-1-picryhydrazyl (DPPH) et le sel diammonique du 2,2-azino-bis (acide 3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique) (ABTS).

Dosage du DPPH

L’activité antioxydante a été réalisée comme décrit par Du Toit et al. avec de légères modifications. Les échantillons ont été dissous dans du méthanol de qualité HPLC (Sigma-Aldrich, Allemagne) et dilués en série deux fois jusqu’à des gammes de concentration de 1000 à 7,81 μg/ml pour les extraits et les fractions, et de 40 à 0,31 μg/ml pour une référence standard d’acide L-ascorbique (Sigma, Allemagne). Brièvement, 40 μl de (10 mg/ml) d’échantillons ont été introduits dans une plaque de microtitrage à 96 puits (Bioster, Espagne) et dilués deux fois en série dans du méthanol. Ensuite, 160 μl de (3,7 mg/100 ml) solution méthanolique de 2,2-diphényl-1-picryhydrazyl (DPPH) ont été introduits dans chaque puits et après 30 min d’incubation à température ambiante dans l’obscurité, l’absorbance a été mesurée à 517 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques multi-mode (BioTek, USA). L’activité de piégeage des radicaux libres de chaque échantillon et de l’étalon de référence a été déterminée en pourcentage de l’inhibition obtenue à partir de la formule suivante :

Avec Absample comme absorbance de l’extrait avec DPPH, Abblank comme absorbance de l’extrait sans DPPH et Abcontrol comme absorbance du méthanol et du DPPH. La concentration des échantillons réduisant 50% des radicaux libres DPPH (IC50) a été déterminée en traçant le pourcentage d’inhibition en fonction des concentrations des échantillons. L’essai a été répété trois fois et les résultats sont exprimés en moyenne ± écart-type.

Dosage ABTS

La capacité de piégeage du radical ABTS des extraits et des fractions a été déterminée en utilisant une méthode de Re et al. avec de légères modifications. Brièvement, le radical ABTS a été généré en faisant réagir une solution 7 mM d’ABTS et une solution 2,45 mM de persulfate de potassium à température ambiante pendant 12 h. L’absorbance de la solution mère de radicaux ABTS a été ajustée à 7,00 ± 0,02 à 734 nm avant d’être utilisée. 40 μl d’une solution d’extraits ou de fractions dissous dans du méthanol de qualité HPLC (Sigma-Aldrich, Allemagne) ont été introduits dans des plaques de microtitrage et dilués en série par un facteur de traction jusqu’à une gamme de concentrations de 15,62 et 2000 μg/ml. Le trolox (Sigma, Allemagne) et l’acide L-ascorbique (Sigma, Allemagne) ont été préparés à des concentrations allant de 200 à 1,56 μg/ml. Ensuite, 160 μl de solution d’ABTS ont été ajoutés aux puits (à l’exception du blanc) et l’absorbance a été mesurée à 734 nm après 6 min d’incubation à température ambiante. Le trolox et l’acide ascorbique ont été utilisés comme contrôles positifs, le méthanol comme contrôle négatif et les extraits ou fractions sans ABTS comme blanc. Le pourcentage d’inhibition de l’ABTS-+ et la CI50 ont été calculés comme indiqué ci-dessus pour l’essai DPPH.

Essai de cytotoxicité

La cytotoxicité des extraits d’acétone et des fractions contre les cellules rénales de singe Vero a été évaluée par l’essai de réduction du MTT comme décrit précédemment avec de légères modifications. Les cellules ont été ensemencées à une densité de 1 × 105 cellules/ml (100 μl) dans des plaques de microtitrage à 96 puits et incubées à 37°C et 5% de CO2 dans un environnement humidifié. Après 24 h d’incubation, des échantillons (100 μl) à des concentrations finales variables ont été ajoutés aux puits contenant les cellules. La doxorubicine a été utilisée comme référence positive. Un contrôle à blanc approprié avec des concentrations équivalentes d’acétone a également été inclus et les plaques ont été incubées davantage pendant 48 h dans un incubateur à CO2. Par la suite, le milieu dans chaque puits a été aspiré des cellules, qui ont ensuite été lavées avec du PBS, et enfin du milieu frais (200 μl) a été ajouté à chaque puits. Ensuite, 30 μl de MTT (5 mg/ml dans du PBS) ont été ajoutés à chaque puits et les plaques ont été incubées à 37°C pendant 4 h. Le milieu a été aspiré des puits et du DMSO a été ajouté pour solubiliser les cristaux de formazan formés. L’absorbance a été mesurée sur un lecteur de microplaques BioTek Synergy à 570 nm. L’inhibition de la croissance cellulaire pour chaque extrait a été exprimée en termes de valeurs LC50, définies comme la concentration qui a provoqué une inhibition de 50 % de la viabilité cellulaire. Les valeurs de l’indice de sélectivité (IS) ont été calculées en divisant les valeurs LC50 de cytotoxicité par les valeurs CMI (IS = LC50/CMI). Les tests ont été réalisés en quadruple exemplaire et chaque expérience a été répétée trois fois.

Analyse statistique

Toutes les expériences ont été réalisées en triple exemplaire et les valeurs exprimées en moyenne ± écart-type. Les différences entre les valeurs ont été évaluées pour la signification en utilisant l’analyse de la variance et les résultats ont été comparés en utilisant la différence la moins significative (LSD) de Fisher à un niveau de signification de 5%.