L’interaction des rayons X avec les électrons d’un cristal donne lieu à un diagramme de diffraction, qui est mathématiquement la transformée de Fourier de la distribution de la densité électronique. Les détecteurs utilisés pour mesurer les rayons X, cependant, ne peuvent mesurer que l’amplitude des rayons X diffractés ; les déphasages, qui sont nécessaires pour utiliser la transformée de Fourier et trouver la distribution de densité électronique, ne sont pas mesurables directement par cette méthode. Ce phénomène est connu dans la communauté des physiciens sous le nom de « problème de phase ». En termes plus simples, les phases ne peuvent pas être trouvées à partir des amplitudes mesurées des rayons X. D’autres extrapolations doivent être faites. D’autres extrapolations doivent être faites et des expériences supplémentaires doivent être réalisées afin d’obtenir une carte de densité électronique. Souvent, les données existantes sur les propriétés physiques et chimiques du composé peuvent aider à obtenir une carte de densité médiocre. Une autre méthode, connue sous le nom de synthèse de Patterson, est très utile pour obtenir une estimation initiale des phases et elle est très utile pour les étapes initiales de la détermination de la structure des protéines lorsque les phases ne sont pas connues. Le problème peut être simplifié en trouvant un atome, généralement un métal lourd, à l’aide de la synthèse de Patterson, puis en utilisant la position de cet atome pour estimer les phases initiales et calculer une carte de densité électronique initiale qui peut ensuite aider à la modélisation de la position des autres atomes et améliorer encore l’estimation des phases. Une autre méthode, appelée remplacement moléculaire, permet de localiser l’emplacement de la structure protéique dans la cellule. En plus de la méthode de remplacement moléculaire, le problème de phase peut également être résolu par la méthode de remplacement isomorphe, la méthode de diffraction anomale à longueurs d’onde multiples, la méthode de diffraction anomale à longueur d’onde unique et les méthodes directes.

Remplacement moléculaireEdit

Le problème de phase peut être résolu en ayant un modèle atomique qui peut calculer les phases. Un modèle peut être obtenu si la structure protéique associée est connue. Cependant, pour construire ce modèle atomique, il faut déterminer l’orientation et la position du modèle dans la nouvelle cellule unitaire. C’est là qu’intervient la technique, le remplacement moléculaire (ou MR).

Le remplacement moléculaire, également connu sous le nom de MR, est une méthode permettant de résoudre les problèmes de phase en cristallographie aux rayons X. Le MR localise l’orientation et la position d’une structure protéique avec sa cellule unitaire, dont la structure protéique est homologue à la structure protéique inconnue qui doit être déterminée. Les phases obtenues peuvent aider à générer des cartes de densité électronique et à produire des intensités calculées de la position du modèle de structure protéique aux structures observées à partir de l’expérience de cristallographie aux rayons X.

La méthode RM est également efficace pour résoudre les structures cristallines macromoléculaires. Cette méthode nécessite moins de temps et d’efforts pour la détermination de la structure, car il n’est pas nécessaire de préparer les dérivés d’atomes lourds et de collecter les données. La méthode est directe et la construction du modèle est simplifiée car elle ne nécessite pas de traçage de chaîne.

Cette méthode se compose de deux étapes :

1. une recherche rotationnelle pour orienter le modèle homologue dans la cellule unitaire ou la cible
2. une cible translationnelle où le nouveau modèle orienté est positionné dans la cellule unitaire

Modification basée sur Patterson (remplacement moléculaire)

Les cartes de Patterson sont des cartes vectorielles interatomiques qui contiennent des pics pour chaque atome lié dans la cellule unitaire. Si les cartes de Patterson ont été générées à partir des données dérivées des cartes de densité électronique, les deux cartes de Patterson devraient être étroitement liées l’une à l’autre uniquement si le modèle est correctement orienté et placé dans la bonne position. Cela nous permettra de déduire des informations sur l’emplacement de la structure protéique inconnue avec sa cellule. Cependant, il y a un problème avec le remplacement moléculaire, il a six dimensions, trois paramètres pour spécifier l’orientation et la position. Avec les cartes de Patterson, il peut être divisé en sous-ensembles de paramètres pour regarder chaque partie séparément.

Fonction de rotationEdit

La fonction de rotation a des vecteurs intramoléculaires qui ne dépendent que de l’orientation de la molécule et non de sa position car même lorsque la molécule est translatée dans la cellule unitaire, tous les atomes sont décalés de la même quantité mais les vecteurs entre les atomes sont les mêmes. La carte de Patterson pour la structure protéique inconnue est comparée à la structure protéique homologue connue dans différentes orientations

Fonction de rotation classiqueEdit

Pour trouver l’orientation, il faut déterminer l’axe de rotation et l’angle de rotation autour de cet axe. Deux paramètres seront nécessaires pour définir un axe (un vecteur du centre de la sphère à un point de la surface de la sphère). L’axe de rotation commence parallèlement à l’axe z et est tourné autour de l’axe y avec un angle ᶱ, puis l’objet tourne autour de l’axe z avec un angle ᶲ, et enfin il tourne autour de l’axe de rotation avec un angle ᵠ. Ceux-ci spécifient un point sur la surface d’une sphère unitaire.

Fonction de rotation rapideEdit

La fonction de rotation peut être calculée en comparant deux cartes de Patterson ou les pics dans ces Patterson. La fonction de rotation peut être calculée beaucoup plus rapidement avec les transformées de Fourier seulement si les Patterson étaient exprimés en termes d’harmoniques sphériques.

Fonction de rotation directeEdit

Dans la fonction de rotation directe, la structure protéique peut être placée dans la cellule unitaire de la structure inconnue et le Patterson pour la molécule orientée est comparé au Patterson de la structure inconnue entière.

Fonction de traductionEdit

Une fois que l’orientation de la structure connue est connue son modèle (carte de densité électronique) peut être orienté pour calculer les facteurs de structure où une fonction de corrélation est utilisée pour déterminer le vecteur pour traduire le modèle sur le dessus de l’homologue dans une unité asymétrique.

Avec les modèles de phase orientés et traduits corrects de la structure protéique, il est assez précis pour dériver les cartes de densité électronique à partir des phases dérivées. Les cartes de densité électronique peuvent être utilisées pour construire et affiner le modèle de la structure inconnue.

Diffraction anormale à plusieurs longueurs d’ondeEdit

Les rayons X sont générés dans de grandes machines appelées synchrotrons. Les synchotrons accélèrent les électrons à presque la vitesse de la lumière et les font voyager dans un grand anneau polygonal métallique creux. À chaque coin, des aimants courbent le flux d’électrons, provoquant l’émission d’énergie sous forme de rayonnement électromagnétique. Puisque les électrons se déplacent à la vitesse de la lumière, ils émettent des rayons X à haute énergie.

Les avantages de l’utilisation des synchrotrons est que les chercheurs n’ont pas à cultiver de multiples versions de chaque molécule cristallisée, mais au contraire à cultiver un seul type de cristal qui contient du sélénium. Ils ont ensuite la possibilité de régler la longueur d’onde en fonction des propriétés chimiques du sélénium. Cette technique est connue sous le nom de diffraction anomale à longueurs d’onde multiples. Les cristaux sont ensuite bombardés plusieurs fois avec des longueurs d’onde de différentes longueurs, et finalement un modèle de diffraction émerge qui permet aux chercheurs de déterminer l’emplacement des atomes de sélénium. Cette position peut être utilisée comme référence, ou marqueur, pour déterminer le reste de la structure. Les avantages de cette méthode permettent aux chercheurs de collecter leurs données beaucoup plus rapidement.

Méthode de remplacement isomorpheEdit

Cette méthode compare les diagrammes de diffraction des rayons X entre le cristal de protéine original et le même type de cristal avec un ajout d’au moins un atome de numéro atomique élevé. Cette méthode a été utilisée pour déterminer la structure de petites molécules et finalement celle de l’hémoglobine par Max Ferdinand Perutz (1914-2002). On parle d’isomorphisme parfait lorsque le cristal original et son dérivé ont exactement la même conformation de la protéine, la position et l’orientation des molécules, et les paramètres de la cellule unitaire. La seule différence que le cristal et son dérivé présentent dans un isomorphisme parfait est la différence d’intensité due à l’ajout d’atomes lourds sur le dérivé. Ces différences peuvent être identifiées manuellement ou par une procédure de recherche automatique de Patterson, comme SIR 2002, SHELXD, nB et ACORN, et ces informations sont importantes pour déterminer les angles de phase des protéines. Cependant, l’isomorphisme parfait ne se produit guère en raison du changement de dimensions des cellules. Pour la protéine à atome lourd, le changement tolérable de la dimension de la cellule est de dmin/4, dmin étant la limite de résolution. D’autres facteurs, comme la rotation, contribuent également au non-isomorphisme.

ProcéduresModifier

1. Préparez quelques dérivés de la protéine en structure cristalline. Ensuite, mesurer la dimension des cellules pour vérifier l’isomorphisme.
2. Collecter les données d’intensité des rayons X de la protéine originale et de son dérivé.
3. Appliquer la fonction Patterson pour déterminer les coordonnées de l’atome lourd.
4. Raffiner les paramètres de l’atome lourd et calculer l’angle de phase de la protéine.
5. Calculer la densité électronique de la protéine.

Les dérivés sont réalisés par deux méthodes différentes. La méthode privilégiée consiste à tremper le cristal de protéine dans une solution dont la composition est identique à celle de la liqueur mère, mais avec une légère augmentation de la concentration du précipitant. Une autre méthode est la co-cristallisation, mais elle n’est pas couramment utilisée car le cristal ne croît pas ou croît de manière non isomorphe. La procédure de trempage dépend de la largeur des pores du cristal. Les pores doivent être suffisamment larges pour que le réactif diffuse dans le cristal et atteigne les sites réactifs à la surface de toutes les molécules de protéines dans le cristal.

Méthode de diffraction anormale à longueurs d’onde multiplesEdit

La diffraction anormale à longueurs d’onde multiples (abrégée MAD) est une méthode utilisée en cristallographie aux rayons X qui nous permet de déterminer les structures des macromolécules biologiques, telles que les protéines et l’ADN, afin de résoudre le problème de phase. Les conditions requises pour la structure comprennent des atomes qui provoquent une diffusion importante des rayons X, notamment le soufre ou les ions métalliques des métalloprotéines. Comme le sélénium peut remplacer le soufre naturel, il est plus couramment utilisé. L’utilisation de cette technique facilite grandement l’utilisation par le cristallographe de la méthode de remplacement isomorphe multiple (MIR) car la préparation de composés lourds est superflue.

cette méthode est utilisée pour résoudre les problèmes de phase, lorsqu’il n’y a pas de données disponibles concernant la diffraction diffusée en dehors des amplitudes. De plus, elle est utilisée lorsqu’un atome de métal lourd est déjà lié à l’intérieur de la protéine ou lorsque les cristaux de la protéine ne sont pas isomorphes, ce qui ne convient pas à la méthode MIR. La méthode a été principalement utilisée pour les solutions de métaux lourds, ces enzymes métalliques proviennent normalement de la première série de transition et de leurs voisins. Il est important d’avoir une source de champ magnétique puissant pour réaliser cette expérience, un environnement tel que le sous-sol doit être considéré. Un accélérateur de particules appelé synchrotron est également nécessaire pour cette méthode.

Méthode de diffraction anormale à une seule longueur d’ondeEdit

Par rapport à la diffraction anormale à plusieurs longueurs d’onde (MAD), la diffraction anormale à une seule longueur d’onde (SAD) utilise un seul ensemble de données provenant d’une seule longueur d’onde. La principale différence bénéfique entre la MAD et la SAD est que le cristal passe moins de temps dans le faisceau de rayons X avec la SAD, ce qui réduit les dommages potentiels causés par le rayonnement à la molécule. De plus, comme la SAD n’utilise qu’une seule longueur d’onde, elle est plus efficace en termes de temps que la MAD.

Les cartes de densité électronique dérivées des données de diffraction anormale à une seule longueur d’onde doivent effectivement subir des modifications pour résoudre les ambiguïtés de phase. Une technique de modification courante est l’aplatissement au solvant, et lorsque la SAD est combinée à l’aplatissement au solvant, les cartes de densité électronique qui en résultent sont de qualité comparable à celles qui sont dérivées de la mise en phase MAD complète. L’aplatissement du solvant implique l’ajustement de la densité électronique des régions interstitielles entre les molécules de protéines occupées par le solvant. La région du solvant est supposée être relativement désordonnée et sans caractéristiques par rapport à la protéine. Le lissage de la densité électronique dans les régions du solvant améliorera la densité électronique de la protéine à un degré interprétable. Cette méthode est appelée ISAS, itérative single-wavelength anomalous scattering.

Méthodes directesEdit

La méthode directe peut aider à récupérer les phases en utilisant les données qu’elle obtient. La méthode directe estime les phases initiale et d’expansion en utilisant une relation triple. La relation triple (trio) est la relation de l’intensité et de la phase d’une réflexion avec deux autres intensités et phases. Lors de l’utilisation de cette méthode, la taille de la structure protéique a de l’importance puisque la distribution de probabilité de la phase est inversement proportionnelle à la racine carrée du nombre d’atomes. La méthode directe est la technique la plus utile pour résoudre les problèmes de phase.