Bases structurelles du mécanisme d’action

L’ARNr 16S d’Escherichia coli est bien étudié parmi les sous-unités d’ARNr, et en particulier, les interactions de divers antibiotiques aminoglycosides avec l’ARNr 16S et leurs effets sur le processus de traduction de l’ARNm en polypeptide ont été scrutés (35). Des structures d’ARNr similaires existent dans d’autres organismes, tels que la levure et Tetrahymena (33). Le traitement de l’ARNr avec un aminoglycoside protège plusieurs bases nucléiques de l’ARNr de toute modification chimique, ce qui implique que ces molécules possèdent des affinités élevées pour certains sites de l’ARNr. Ce mode de liaison a été comparé par Noller (35) à celui des inhibiteurs d’enzymes, qui se lient généralement aux sites actifs des enzymes et interfèrent avec leurs activités. Différentes classes d’antibiotiques aminoglycosides se lient à différents sites sur l’ARNr, en fonction de la complémentarité structurelle entre les deux. Par exemple, on pense que la néomycine, la paromomycine (Fig. 1), la gentamicine et la kanamycine se lient au site A de l’ARNr 16S d’E. coli de manière similaire et il a été démontré qu’elles protègent les bases A1408 et G1494 dans des expériences d’empreinte chimique (Fig. 2) (33). Quatre bases, A1408, A1492, A1493, et G1494, dans le site A de l’ARNr interagissent avec l’ARNt, bien qu’avec des affinités différentes. La liaison des aminoglycosides susmentionnés au site A de la région de décodage (c’est-à-dire le site de reconnaissance des codons et des anticodons) interfère avec la reconnaissance précise de l’ARNt correspondant par l’ARNr pendant la traduction (35). On pense également que ces interactions interfèrent avec la translocation de l’ARNt du site A au site peptidyl-ARNt (site P).

Puglisi et ses collègues (12-14, 39) ont récemment fourni des preuves structurelles sur le mode d’interactions de la paromomycine, un aminoglycoside représentatif de la classe de la néomycine, avec une matrice d’ARN de 27 nucléotides qui a été conçue pour imiter la région du site A de l’ARNr 16S dans E. coli (Fig.3A). La conception de la matrice d’ARN était basée sur les connaissances antérieures que la paromomycine interagit avec la paire de bases C1407 – G1494, A1408, A1493 et U1495 et que ces bases sont absolument nécessaires pour une liaison de haute affinité (39) (représenté en gris dans la Fig. 3A). D’autres caractéristiques structurelles, telles que la poche créée par l’asymétrie de la région de la boucle interne due à la présence de A1492 et l’appariement de bases C1409 – G1491 dans la région de la tige inférieure, sont également importantes. Ces caractéristiques structurelles créent collectivement une poche qui est optimale pour la liaison de la paromomycine (voir ci-dessous).

Dans le modèle d’ARN du site A natif, la tige a des interactions d’appariement de bases à U1406 – U1495 (non canonique) et C1407 – G1494 (Fig 3A). Lors de la liaison de la paromomycine, la structure distincte formée par A1408, A1492, et A1493 est stabilisée (Fig. 2B) et les bases A1408 et A1493 forment une paire de bases non canonique (12, 39). Le nucléotide A1492, qui n’a aucune interaction d’appariement de bases, crée un coude dans la structure de l’ARN, et les effets combinés de A1492 et de la paire de bases A1408 – A1493 créent un renflement dans le site A où la paromomycine se lie et étend encore l’angle du coude (Fig.2B). Les groupes fonctionnels sur la paromomycine, tels que les groupes hydroxyle et amino, participent à des interactions spécifiques avec la molécule d’ARN (voir ci-dessous).

La poche créée par A1492 et la paire de bases A1408 – A1493 est occupée par l’anneau II de la paromomycine, et cet anneau s’empile au-dessus de la base G1491 (représentée par une flèche jaune sur la figure 2B) (12). L’anneau I de la paromomycine établit des contacts spécifiques avec les paires de bases  » universellement  » conservées U1406 – U1495 et C1407 – G1494 dans l’ARNr. Il convient de noter que le cycle I est absolument nécessaire à la liaison spécifique des antibiotiques aminoglycosides à l’ARNr. Les anneaux III et IV de la paromomycine étendent ces interactions plus loin dans le sillon majeur de l’ARNr. Les fragments amino et hydroxyle contribuent principalement aux interactions non spécifiques de la paromomycine avec l’ARNr ; il ne s’agit donc pas d’interactions dépendant de la séquence. Un autre point important est que la paire de bases C1409 – G1491 fournit le siège pour la liaison de l’aminoglycoside dans la poche, et une paire de bases mal assortie dans cette position entraîne la perte de liaison (12). En général, les aminoglycosides qui partagent des caractéristiques structurelles avec la paromomycine se lient à l’ARNr de manière similaire (13). Cependant, différents antibiotiques aminoglycosides semblent se lier au même site de liaison dans plus d’une conformation (28). En fait, la conformation de l’aminoglycoside qui se lie à l’ARN doit satisfaire les contraintes électroniques et stériques du site de liaison. Dans une autre étude sur le complexe de la gentamicine Cla et de la matrice d’ARN du site A, les anneaux I et II de la gentamicine Cla (qui sont similaires à ceux de la paromomycine) ont présenté des interactions de liaison similaires à celles du complexe de la paromomycine et de la matrice d’ARN du site A (57). Cependant, l’anneau III de la gentamicine Cla interagit avec les paires de bases U1406 – U1495 et G1405 – C1496 dans la région supérieure de la tige (Fig. 3A). A partir de ces observations, Puglisi et ses collègues (57) ont proposé que tous les aminoglycosides qui ciblent le site A de l’ARNr 16S se lient d’une manière commune, similaire aux anneaux I et II dans la paromomycine et la gentamicine.

Bien que la structure globale de l’ARNr soit conservée chez toutes les espèces au sens de l’évolution, il existe des différences qui rendent la liaison des aminoglycosides plus spécifique – par une affinité au moins 10 fois plus élevée – à l’ARNr des procaryotes qu’à celui des eucaryotes (19, 35, 38). Il ne s’agit pas d’une grande différence d’affinité de liaison et cela peut expliquer en partie les effets toxiques de ces antibiotiques dans les systèmes des mammifères. L’ARNr eucaryote contient une guanine à la place de A1408, ce qui donne une paire de bases G1408 – A1493. En outre, la paire de bases appariées C1409 – G1491 n’existe pas chez les eucaryotes. Ces différences se traduisent collectivement par des affinités plus faibles des aminoglycosides pour l’ARNr eucaryote (12, 19, 35, 38). Après avoir souligné ces différences, la liaison des aminoglycosides au site A de l’ARNr chez les procaryotes modifie la conformation du site A et affecte les interactions spécifiques de l’ARNm et de l’ARNt à ce site, ce qui entraîne des interactions codon-anticodon erratiques. Il existe à ce jour peu d’informations structurelles sur les spécificités de ces interactions au niveau ribosomal (voir ci-dessous), mais la conséquence claire et ultime est la perturbation du processus de traduction.

Une autre étude structurelle a été réalisée sur la liaison de la tobramycine (Fig.1) à un aptamère d’ARN (23). L’aptamère d’ARN qui a été utilisé dans cette étude était un ARN à tige-boucle de 26 nucléotides (Fig. 3B). Il y a quatre paires de mésappariements, U7 – G20, G8 – U19, G9 – A18, et U11 – U16, dans cet aptamère d’ARN qui font partie de la boucle en épingle à cheveux. La tobramycine se fixe dans ce sillon partiellement encapsulé par la surface du sillon profond et la base guanine du résidu G15 (Fig. 4). Dans ce complexe, le cycle I de la tobramycine se trouve sur le plancher du sillon profond. L’un des groupes amino du cycle II de la tobramycine interagit avec le squelette phosphate dans le sillon profond, et l’autre groupe amino est exposé au solvant. Le cycle III est positionné au centre du sillon profond, avec des groupes hydroxyle dirigés vers le fond du sillon. La conformation de l’aptamère d’ARN décrit ci-dessus a été suggérée comme étant similaire à celles des boucles en épingle à cheveux dans les ARNt et les ARNr (23).

La structure radiographique à résolution de 7,5 Å du complexe fonctionnel de l’ARNr 70S deT. thermophilus contenant l’ARNt et l’ARNm est utile pour mettre en perspective la discussion ci-dessus (5). À partir de cette structure, on peut imaginer comment les études modèles avec des modèles d’ARN plus petits, comme l’aptamère tobramycine-ARN et l’ARN à site A avec la paromomycine (voir ci-dessus), s’intégreraient dans la structure complète de l’ARNr. Le site A dans la sous-unité 16S de l’ARNr 70S est vu près de l’interface de l’ARNt et de la sous-unité 50S de l’ARNr, à proximité de la paire codon-anticodon (Fig. 2A). Après comparaison de la structure en solution de la matrice d’ARN du site A avec le site A de la structure radiographique de l’ARNr 70S, la structure radiographique semblait être étroitement liée à la matrice d’ARN liée à la paromomycine, mais pas à la structure en solution native de la matrice d’ARN du site A (5). Ceci est intriguant et suggère que peut-être, dans la forme fonctionnelle, le renflement ou le coude près des bases A1492 et A1493 existe toujours dans l’ARNr 70S. Si cela était vrai, cela implique que la poche de liaison pour la paromomycine existe déjà lorsque l’ARNr 70S devient fonctionnel ; il est donc prédisposé à l’inhibition par la paromomycine. Cela contredit l’affirmation selon laquelle la liaison de la paromomycine augmente l’angle de pliage au niveau du site de liaison. Des preuves à l’appui de cette idée proviennent d’une étude récente qui suggère que les affinités de différents aminoglycosides pour la matrice ARN du site A sont différentes, et que la capacité de ces antibiotiques à inhiber la synthèse des protéines in vitro varie également (15). La gentamicine et plusieurs autres antibiotiques apparentés interagissent avec l’ARN du site A avec des constantes de dissociation (Kd) de l’ordre du micromolaire, mais ils ont inhibé un processus de traduction in vitro, avec des concentrations inhibitrices de 50 % de l’ordre du nanomolaire (15). Cette dernière constatation a été déduite comme le résultat de la liaison de l’aminoglycoside à l’ARNr intact dans la région de décodage (site A), et la différence de liaison à l’ARNr intact par rapport à celle à l’ARN matrice du site A peut être due aux différences de conformations de ces deux ARN, comme discuté ci-dessus.

Le site A établit des contacts faibles avec l’ARNm et l’ARNt, ce qui implique que cette région joue un rôle dans la reconnaissance de l’ARNt approprié via des changements subtils de l’énergie libre (5). La liaison de l’aminoglycoside près de ce site peut affecter le processus délicat des interactions entre le codon et l’anticodon. Il a également été proposé que la présence d’un aminoglycoside stabilise le complexe d’ARNm et d’ARNt au niveau du site A, ce qui affecte à son tour le processus de traduction (5). Il est difficile de supposer tous les effets des aminoglycosides sur la structure de l’ARNr, et d’autres études structurelles avec les aminoglycosides liés aux complexes, comme l’ARNr 70S, seront utiles pour élucider et comprendre les changements subtils qui conduisent aux actions antibiotiques des aminoglycosides.

Un certain nombre d’enquêtes ont utilisé des sondes synthétiques pour comprendre les interactions entre les matrices d’ARN et les aminoglycosides. Il a été suggéré que les aminoglycosides se lient à plus d’un site cible dans le ribozyme (6, 30). Récemment, plusieurs antibiotiques aminoglycosides tels que la néomycine B, la tobramycine et la kanamycine A ont été dimérisés de façon symétrique ou asymétrique à l’aide d’un « tether », et leurs affinités de liaison ont été comparées à celles des aminoglycosides parents monomères (30). Il a été suggéré que s’il y avait plusieurs sites de liaison sur l’ARN, les aminoglycosides dimérisés devraient se lier avec une affinité plus élevée que l’antibiotique parent, à condition que plusieurs sites de liaison soient accessibles. On a effectivement observé que les aminoglycosides dimérisés se lient au ribozyme de Tetrahymena 20 à 1 200 fois mieux que les aminoglycosides parents. Une explication de cette affinité de liaison plus élevée pourrait être le nombre accru de groupes amino chargés positivement sur l’aminoglycoside dimérisé, mais cet effet semble être synergique avec l’avantage entropique obtenu par la dimérisation (30). Cela a également indiqué la présence de multiples sites de liaison à haute affinité pour les antibiotiques aminoglycosides dans une molécule d’ARN. Une autre étude a tenté d’exploiter les propriétés de liaison à l’ARN de la paromomycine et les comportements d’intercalation de certains composés tels que le pyrène et le thiazole orange (48). Cette stratégie envisageait les aminoglycosides comme un moyen de délivrer des agents intercalaires à l’ARN. Le conjugué de la paromomycine avec l’orange de thiazole ou le pyrène a montré de meilleures propriétés de liaison à la matrice d’ARN de 27 nucléotides du site A. En effet, la constante de dissociation de la paromomycine avec l’orange de thiazole et le pyrène est plus élevée que celle de la paromomycine. En fait, la constante de dissociation pour le conjugué paromomycine-thiazole orange a été mesurée à 46 nM, ce qui a été rapporté comme la plus grande affinité que le site A de l’ARNr a montré pour n’importe quel ligand.

Les exigences structurelles pour la liaison de l’ARN par les aminoglycosides ont indiqué qu’un renflement dans la séquence de l’ARN est nécessaire pour permettre la liaison des aminoglycosides (7). En utilisant un dérivé spécifique de la tige-boucle de l’aptamère d’ARN, une série d’études d’interférence chimique, de modification chimique et de mutation a été réalisée pour comprendre les exigences structurelles de la liaison de la tobramycine à l’aptamère d’ARN. Cet aminoglycoside semble interagir principalement avec les bases nucléiques de l’aptamère d’ARN, mais pas avec le squelette phosphate. La présence d’un renflement, cependant, a été proposée comme étant importante pour la liaison de haute affinité de la tobramycine dans un rapport stœchiométrique, et il a été conclu qu’un renflement crée une cavité pour les interactions de l’aminoglycoside et de la base nucléique (7). Cette analogie peut être appliquée à d’autres sites de l’ARN tels que la région du marteau et le site A, où une cavité est présente en raison de l’appariement non canonique des bases, des boucles ou des renflements qui créent un site approprié pour que les aminoglycosides interagissent avec les groupes phosphate anioniques et les bases nucléiques. Dans cette optique, Westhoff et ses collègues (49) ont proposé que l’interaction des aminoglycosides avec l’ARN soit probablement spécifique de la forme plutôt que de la séquence.

En accord avec ce concept, les champs électrostatiques dans les plis de l’ARN ont été considérés comme la force directrice de la liaison (voir ci-dessous). Hermann et Westhoff (20) ont pu identifier les confirmations de docking de plusieurs antibiotiques aminoglycosides dans divers modèles d’ARN, tels que les aptamères tobramycine-ARN et la région du site A dans l’ARN 16S, pour lesquels des informations structurelles étaient disponibles. Sur la base de ces observations, le mode de liaison des aminoglycosides à la région de l’élément de réponse trans-activateur du VIH a été prédit (20). Dans une autre étude sur le RRE du VIH, la région de liaison de la protéine Rev, Cho et Rando (8) ont étudié le rôle d’un renflement à base unique et d’une cavité pour la liaison des aminoglycosides. Conformément aux hypothèses précédentes, ils ont déduit que les sillons dans les régions non duplex de l’ARN sont importants pour la liaison à haute affinité des aminoglycosides à l’ARN. Dans ce cas, le renflement d’une seule base n’a pas affecté la liaison, mais la cavité, une région riche en G constituée de deux paires de bases non canonique et d’un seul U renflé, a une forte affinité pour les aminoglycosides. L’altération de la cavité a diminué l’affinité de l’ARN RRE pour les aminoglycosides, indiquant ainsi que les renflements contenant des paires de bases non canonique sont les sites primaires de liaison aux aminoglycosides dans cette matrice d’ARN (8).