Matériels et méthodes

Collecte d’échantillons

Les participants âgés de 18 ans et plus ont été invités à se joindre à l’étude par le biais de notifications par courriel et d’annonces placées sur les tableaux d’affichage de l’Université de Colombie-Britannique, Vancouver BC. Les participants ont été invités à fournir des échantillons à l’aide d’écouvillons buccaux floqués à sec (Puritan PurFlock, Fisher Scientific, Waltham MA) et d’écouvillons buccaux à bout éponge (Oragene ORAcollect, DNA Genotek, Ottawa, ON) en suivant des instructions autoguidées ; l’ordre dans lequel ces échantillons ont été donnés a été randomisé par ordinateur. Un assistant de recherche était présent pendant le prélèvement des échantillons pour répondre aux questions des participants concernant les instructions pour le prélèvement des échantillons. Tous les échantillons ont été conservés à la température ambiante. Les rapports pharmacogénétiques n’ont pas été remis aux participants, car cela n’entrait pas dans le cadre de cette étude.

Extraction d’ADN

L’ADN a été extrait à l’aide du kit d’extraction d’ADN à base de billes Ambion MagMAX (Applied Biosystems, Foster City, CA) conformément aux instructions du fabricant. L’ADN a été extrait 3 jours après le prélèvement de l’échantillon et élué dans 60 µl. La quantité et la qualité de l’ADN ont été évaluées à l’aide du test de fluorescence Qubit 2.0 (ThermoFisher Scientific, Waltham MA). La pureté des échantillons a été déterminée par les valeurs de densité optique A260/280 (ODA260/280) en utilisant le spectrophotomètre NanoVue.

Génotypage

Le génotypage a été réalisé sur l’instrument de réaction en chaîne par polymérase quantitative (qPCR) QuantStudio 12K Flex (LifeTechnologies, Carlsbad, CA) sur des tests validés par le fabricant (ThermoFisher Scientific, Waltham MA). Le contenu des tests comprenait 28 SNP influençant la réponse aux médicaments sur la plateforme OpenArray (voir fichier additionnel 2) et un test TaqMan CYP2D6 CNV (Assay ID : Hs_00010001_cn). Pour valider les tests, 44 contrôles d’ADN provenant du National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), Human Genetic Cell Repository au Coriell Institute for Medical Research ont été génotypés. La concordance des appels a été confirmée avec le génotype attendu. En outre, le séquençage Sanger de l’ADN de contrôle a permis de vérifier les résultats. Pour chaque série, les échantillons des participants ont été analysés en double sur l’OpenArray et en quadruple sur le test CNV avec les échantillons d’ADN de Corriell utilisés comme contrôles positifs et contrôles sans gabarit (NTC).

Analyse statistique

Le logiciel TaqMan Genotyper v1.3.1 (Applied Biosystems) a été utilisé pour déterminer les taux d’appel de génotypage SNP sur l’OpenArray. Le taux d’appel de génotype a été calculé pour chaque essai OpenArray, en divisant le nombre total de génotypes attribués avec succès par le nombre total de tentatives d’attribution de génotypes.

Pour l’essai CNV TaqMan, le logiciel CopyCaller v2.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) a été utilisé pour attribuer des appels de nombre de copies CYP2D6 et des scores de confiance CNV. Les échantillons d’ADN se sont vus attribuer un nombre de copies diploïdes de type sauvage et les variations du nombre de copies (événements de délétion ou de duplication) ont été regroupées dans les groupes 2N et CNV, respectivement. Un taux d’appel de génotypage de 95 % et un score de confiance de 95 % ont été fixés pour les résultats de génotypage des SNP et des CNV, respectivement. Un test t de Student à deux échantillons, supposant des variances inégales, a été calculé pour déterminer la différence significative entre le rendement, la pureté et les taux d’appel de l’ADN des différents types d’ADN par paires. Les attributions de génotypage générées à partir du type d’échantillon d’ADN (à bouts d’éponge vs à flocons secs) d’un même participant ont été comparées pour calculer la concordance.

Résultats

Trente et un participants ont été recrutés et ont collecté des écouvillons à bouts d’éponge et des écouvillons à flocons secs. Les participants ont trouvé que les instructions auto-guidées pour la collecte étaient simples et faciles à suivre pour les deux types d’écouvillons. Les participants ont soulevé des questions sur la pression nécessaire pour frotter les écouvillons et le placement correct des écouvillons dans la bouche. Les commentaires des participants sur les deux écouvillons étaient similaires, certains préférant les écouvillons à bout éponge et d’autres les écouvillons à blocage sec ; il n’y a pas eu de consensus d’opinion.

Il y avait une différence significative dans le rendement moyen d’ADN entre l’ADN recueilli à l’aide d’écouvillons à blocage sec par rapport aux écouvillons à bout éponge (0,26 ± 0,34 µg contre 1,91 ± 1,44 µg p = 4,4 × 10-7 ; tableau 1). La pureté moyenne de l’ADN pour tous les types de collecte était dans la fourchette acceptée de pour l’ADN pur (moyenne (SD)) 1,72(0,78) et 1,85(0,39) pour les écouvillons secs et les écouvillons à bout éponge, respectivement.

Il y avait trois échantillons recueillis à partir d’écouvillons à bouts d’éponge qui avaient de faibles concentrations d’ADN (< 5 ng/µl). Ces trois échantillons présentaient des taux d’appel de génotypage de 100 % sur OpenArray et des scores de confiance CNV de 100 % (Fig. 1). À l’inverse, l’un des échantillons dont la concentration d’ADN était de 79 ng/µl présentait le taux d’appel OpenArray le plus faible (18 %). Les taux d’appel les plus élevés sur OpenArray (> 95%) pour les écouvillons floqués à sec ont été observés pour sept échantillons dont la concentration était comprise entre 1,2 et 8,9 ng/µl (Fig. 1a). Les appels de confiance CNV les plus élevés (> 95%) ont été observés pour les échantillons dont la concentration était comprise entre 1,0 et 24,4 ng/µl (Fig. 1b).

Pour tous les tests sur l’OpenArray, les échantillons d’ADN recueillis à partir d’écouvillons à bout éponge ont donné lieu à des taux d’appel de génotypage globalement plus élevés (97 %) par rapport aux écouvillons floqués à sec (54 %) (Fig. 2). En ajoutant une étape de dilution de 0,5 × de l’ADN extrait, les écouvillons éponge ont obtenu un taux d’appel génotypique constant > 95 %. Le taux d’appel de l’échantillon sur OpenArray variait selon les individus, 29 (93,5 %) participants ayant un taux d’appel > 95 % à partir de l’ADN de l’écouvillon éponge et 4 (12,9 %) ayant un taux d’appel > 95 % à partir de l’ADN de l’écouvillon sec. Une concordance de 94% de tests génotypés avec succès a été observée entre les écouvillons à l’éponge et les écouvillons floqués à sec recueillis auprès du même individu.

Des appels de numéros de copie pour CYP2D6 ont été attribués à 2(6,5%) des échantillons provenant d’écouvillons éponge avec un score de confiance global de 0,99. En comparaison, 8(25,8%) des échantillons provenant d’écouvillons floqués à sec se sont vus attribuer des appels de numéro de copie avec un score de confiance global de 0,91 (voir le fichier supplémentaire 3).

Discussion

Le but de cette recherche est d’aider les enquêteurs, et les entreprises, à identifier une méthode de collecte optimale qui donne un ADN de haute qualité pour le génotypage. Cette étude fournit de nouvelles informations sur la qualité de l’ADN pour deux types d’écouvillons, qui était élevée (définie comme ODA260/A280 1,8) bien qu’il y ait une différence significative dans le rendement de l’ADN (valeur p = 4,4-7). Sur la plateforme OpenArray, les écouvillons à bout éponge présentaient le taux d’appel de génotypage global le plus élevé (97 % contre 54 %) et le score de confiance le plus élevé pour le test TaqMan CNV CYP2D6 (0,99 contre 0,91). Un taux d’appel de génotypage SNP de > 95 % est considéré comme reflétant des données de qualité acceptable et un score de confiance CNV de 99 % est considéré comme de haute qualité .

Un échantillon d’ADN isolé de l’écouvillon éponge avait un taux d’appel inférieur à 95 %. Dans la pratique de routine des laboratoires, les échantillons ayant un faible taux d’appel seraient recollectés en raison de résultats incomplets pour les rapports des patients. L’omission de cet échantillon a augmenté le taux d’appel global du génotypage à 99,5 % pour les écouvillons éponge.

Les résultats CNV deCYP2D6 ont montré une augmentation des assignations CNV pour l’ADN collecté à partir d’écouvillons floqués à sec 8(25,8 %) par rapport aux écouvillons éponge 2(6,5 %). Un nombre plus élevé d’assignations CNV était corrélé à des scores de confiance plus faibles. La majorité des participants, soit 30 (97%), ont pu collecter des échantillons qui ont donné lieu à des taux d’appel génotypiques élevés pour l’écouvillon éponge, tandis que seulement quelques individus, soit 4 (13%), ont pu collecter des échantillons à taux d’appel élevé pour les deux types d’écouvillons. En conclusion, les écouvillons à bout éponge étaient acceptables pour les patients et fournissaient un ADN de bonne qualité avec un rendement suffisant pour les tests pharmacogénétiques basés sur la qPCR.